同質ヒト疾患モデルは、特定の患者集団の遺伝学をin vitroで正確にモデル化するために選択または改変された細胞ファミリーです。遺伝的に適合した「正常細胞」が提供され、疾患生物学および新規治療薬の研究のための同質系システムを提供します。[1]遺伝的基盤を持つあらゆる疾患のモデル化に使用できます。がんは、同質ヒト疾患モデルが広く使用されている疾患の一つです。
歴史的モデル
ヒト同質遺伝子疾患モデルは、ヒトの遺伝性疾患に関する最新の研究を取り入れており、非ヒトモデルの使用に伴う困難や制限がないため、「試験管の中の患者」に例えられています。[2]
歴史的に、動物、特にマウス由来の細胞は、がん関連経路のモデル化に用いられてきました。しかし、ヒトの遺伝学的に決定された疾患のモデル化に動物を用いることには、明らかな限界があります。ヒトとマウスの間には遺伝的保存性が高いにもかかわらず、マウスとヒトの生物学的特性の間には、がん研究において重要な重要な相違点が存在します。例えば、テロメア制御における大きな違いにより、マウス細胞はヒトのがん形成における律速段階であるテロメラーゼの発現上昇を回避できます。また、特定のリガンド-受容体相互作用は、マウスとヒトの間で適合しません。さらに、実験により、マウス由来の細胞と比較して、細胞の形質転換能力に重要な違いがあることが示されています。これらの理由から、ヒト細胞を用いたがんモデルの開発は依然として不可欠です。[3]
標的ベクター
同質遺伝子細胞株は、相同遺伝子ターゲティングと呼ばれるプロセスによって作製されます。相同組換えを利用するターゲティングベクターは、研究対象となる疾患原因となる変異またはSNP（一塩基多型）をノックインまたはノックアウトするために用いられるツールまたは技術です。疾患変異は癌患者から直接採取できますが、これらの細胞は通常、特定の変異に加えて多くの背景変異を含んでおり、一致する正常細胞株は得られません。その後、ターゲティングベクターを用いて遺伝子変異を「ノックイン」または「ノックアウト」し、 HCT116やNalm6などの特徴付けられたヒト癌細胞株において、正常遺伝子型から癌遺伝子型へ、またはその逆の双方向の切り替えを可能にします。[4]
望ましい変異を設計するために使用される遺伝子標的化技術はいくつかありますが、その中で最も一般的な技術について、主な利点と制限を含めて、以下の概要表に簡単に説明します。
| 技術 | 遺伝子ノックイン | 遺伝子ノックアウト |
|---|---|---|
| rAAV（組み換えアデノ随伴ウイルスベクター）[5] | 標的の挿入または変更は内因性遺伝子内で作成されるため、次のようになります。
rAAVは、微細な点変異、SNP、そして小さな挿入を高い効率で導入することができます。さらに、多くの査読済み研究において、rAAVは標的外のゲノムイベントによる混乱を招かないことが示されています。[要出典] 精度、時間、コストの観点から、学術界、バイオテクノロジー、製薬業界で採用されている好ましい方法のようです。[引用が必要] | |
遺伝子ノックアウトは内因性遺伝子座で行われるため、決定的かつ安定的で、患者にとって意義のあるものです。他のゲノム遺伝子座において、交絡となるオフターゲット効果は誘発されません。このプロセスは2段階に分かれています。
したがって、このプロセスでは 3 つの遺伝子型 (+/+、-/+、-/-) を生成できるため、ハプロ不全遺伝子機能の分析が可能になります。 現在の制限は、単一の対立遺伝子を順番にターゲットにする必要があり、ノックアウト細胞株の生成が 2 段階のプロセスになることです。| |
| プラスミドに基づく相同組換え | 挿入は内在性遺伝子座で行われ、上記の利点をすべて備えていますが、非常に非効率です。また、プロモーターを使用しない薬剤選択戦略が必要となり、特注のコンストラクト作成が必要になります。この方法を用いて、歴史的に大規模な細胞株バンクが作成されてきましたが、1990年代半ば以降、他の方法に取って代わられました。 | 欠失は内因性遺伝子座で行われ、上記の利点をすべて備えているが、効率が悪い。また、プロモーターレスな薬剤選択戦略が必要となり、特注のコンストラクト生成が必要となる。 |
| フリップイン | これは、あらかじめ定義された単一のゲノム座位（FLPリコンビナーゼ部位を介した統合）に「異所性」トランスジーンを誘導的に挿入することを可能にする効率的な技術です。これは内因性座位を改変するための技術ではありません。トランスジーンは通常、外因性プロモーター、または不適切なゲノム位置にある部分的に定義されたプロモーターユニットの制御下にあります。したがって、トランスジーンの発現は内因性座位と同じゲノムおよびエピジェネティック制御下にはないため、遺伝子機能研究におけるこれらのシステムの有用性は限定されます。しかしながら、迅速かつ安定した外因性遺伝子発現を誘導するには優れています。 | 適用できない |
| ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN） | ZFNは、標的の内因性遺伝子において高い遺伝子ノックアウト率を達成することが報告されている。ZFNを標的遺伝子と相同性のあるトランスジーン構造物と共導入すれば、遺伝子ノックインまたは挿入も達成できる。[6]潜在的な欠点の一つは、オフターゲット二本鎖切断がランダムなオフターゲット遺伝子の挿入、欠失、そしてより広範なゲノム不安定性につながり、結果として得られる遺伝子型を混乱させる可能性があることである。[7]しかし、複合24bp認識部位を標的とするZFNで効率的に編集されたヒト細胞では、ランダムなプラスミド組み込み率の測定可能な増加は観察されなかった[6]。 | ZFNは、標的遺伝子の両アレルを迅速かつ高効率（バルク細胞集団で最大90%）に破壊できる配列特異的エンドヌクレアーゼです。ただし、ユーザー定義または患者に関連する機能喪失変異は、同様の頻度で報告されていません。ゲノム上の他の部分における標的外の欠失または挿入は重大な懸念事項です。一段階で両アレルKOを得るという迅速性の利点は、均質な細胞集団における遺伝子機能を研究するためにクローン細胞株を樹立する必要がある場合、部分的に損なわれます。 |
| メガヌクレアーゼ | メガヌクレアーゼはZFNと動作原理が類似しています。メガヌクレアーゼベクターの設計には最大9ヶ月かかり、数万ドルの費用がかかるなど、その使用には固有の制約があります。[要出典]そのため、メガヌクレアーゼは、遺伝子治療、アグロバイオテクノロジー、バイオ生産菌株のエンジニアリングといった高価値アプリケーションにおいて、より魅力的な選択肢となっています。 |
癌細胞疾患モデルにおける相同組換え
相同組換え（HR）は、遺伝子組換えの一種であり、DNAの2つの類似した領域間で遺伝子配列が交換されます。HRは真核生物の細胞分裂において重要な役割を果たし、対応するDNA領域間の交換を通じて遺伝的多様性を促進し、新たな、そして潜在的に有益な遺伝子の組み合わせを生み出します。[要出典]
HRはDNA修復においてもう一つの重要な役割を担い、細胞のライフサイクルにおいて一般的に発生するDNA二本鎖切断の修復を可能にします。このプロセスは、上記の技術によって人工的に誘発され、特定の遺伝子の「ノックイン」または「ノックアウト」を引き起こすためにブートストラップされます5, 7。
最近の重要な進歩は、AAV相同組換えベクターを使用することで発見されました。これは、遺伝子標的ベクター配列と組み合わせることで、分化したヒト細胞におけるHRの低い自然率を増加させます。[引用が必要]
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典型的な rAAV ベクターの図 (出典: https://www.horizondiscovery.com/gene-editing/raav)
商業化
近年、製薬業界や研究機関向けに同質ヒト癌細胞疾患モデルが商品化されている背景には2つの要因がある。[要出典]
まず、強化されたターゲティングベクター技術の特許取得に成功したことで、これらの技術の応用から得られる細胞モデルの商業化の基盤が整いました。[要出典]
第二に、医薬品研究開発における成功率が比較的低い傾向にあり、コストが莫大なことから、個々の遺伝子プロファイルに基づいて、患者のサブグループが標的がん治療薬に対してどのように反応するか、またはどのように抵抗するかを明らかにする新しい研究ツールが本当に必要になっています。[要出典]
参照
参考文献
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