イソペプチド結合
リジンとアスパラギン酸/アスパラギン酸間のイソペプチド結合

イソペプチド結合は、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基の間に形成されるアミド結合の一種です。イソペプチド結合は、あるアミノ酸の側鎖アミノ基またはカルボキシル基と、別のアミノ酸のα-カルボキシル基、α-アミノ基、または側鎖との間の結合です。ユーペプチド結合としても知られる典型的なペプチド結合では、アミド結合は常に、あるアミノ酸のα-カルボキシル基と2番目のアミノ酸のα-アミノ基の間に形成されます。イソペプチド結合は通常のペプチド結合よりもまれです。[ 1 ]イソペプチド結合は、タンパク質の一次配列の分岐につながります。通常のペプチド結合から形成されたタンパク質は、通常、線状の一次配列を持ちます。

アミド結合、ひいてはイソペプチド結合は、カルボニル酸素、カルボニル炭素、および窒素原子間の共鳴（電子の非局在化）によって安定化されます。イソペプチド結合の結合強度は、結合の種類がペプチドと類似しているため、ペプチド結合の強度と同等です。ペプチド結合の結合強度は約300 kJ/mol、つまり約70 kcal/molです。[ 2 ]

リジン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギンなどのアミノ酸は、いずれも側鎖にアミノ基またはカルボキシル基を有するため、イソペプチド結合を形成できます。例えば、リジンとグルタミンの側鎖間のイソペプチド結合の形成は以下のようになります。

  • Gln−(C=O)NH 2 + Lys-NH 3 + → Gln−(C=O)NH−Lys + NH 4 +

リジンの ε-アミノ基は、次の反応のように、他のアミノ酸の α-カルボキシル基とも反応します。

  • イソロイシン(C=O)O − + リジン-NH 3 + → イソロイシン(C=O)NH-リジン + H 2 O

イソペプチド結合の形成は、典型的には酵素触媒による。[ 3 ]上に示したように、リジンとグルタミンの反応は、トランスグルタミナーゼによって触媒される。酵素触媒によるイソペプチド結合形成の別の例は、グルタチオン分子の形成である。トリペプチドであるグルタチオンは、通常のペプチド結合（システインとグリシンの間）とイソペプチド結合（グルタミン酸とシステインの間）を含む。グルタミン酸の γ-カルボキシル基とシステインの α-アミノ基との間のイソペプチド結合の形成は、γ-グルタミルシステイン合成酵素によって触媒される。[ 3 ]細胞内ペプチダーゼ[ 3 ]はこの結合を認識できず、したがって結合を加水分解しないため、ユーペプチド結合の代わりにイソペプチド結合が形成される。バクテリオファージHK97カプシドの成熟過程において観察されるように、イソペプチド結合は自発的に形成されることがある。[ 4 ]この場合、リジンのεアミノ基はアスパラギンの側鎖カルボキサミド基と自己触媒的に反応する。[ 4 ]リジンとアスパラギンの間の自発的なイソペプチド結合形成は、グラム陽性細菌の線毛においても起こる。[ 5 ]

関数

酵素によって生成されるイソペプチド結合には、シグナル伝達と構造という 2 つの主な生物学的目的があります。

バイオシグナリングはタンパク質機能[ 6 ] 、クロマチン凝縮[ 7 ]、タンパク質半減期[ 8 ]に影響を及ぼします。イソペプチド結合の生体構造的役割には、血液凝固[ 9 ]（創傷治癒のため）、細胞外マトリックスの維持[ 10 ]、アポトーシス経路[ 10 ] 、微小管の修正[ 11 ] 、細菌における病原性ピリの形成[ 12 ]などがあります。イソペプチド結合はコレラ菌の病原性に寄与しており、アクチン架橋ドメイン（ACD）がアクチンのグルタミン酸のγカルボキシル基とリジンのεアミノ基の間に分子間結合を形成します。[ 13 ]このプロセスにより、宿主細胞内でのアクチン重合が停止します。[ 13 ]

バイオシグナリング

シグナル伝達を目的としてタンパク質同士を連結するイソペプチド結合については、文献ではユビキチンと類似のタンパク質が主流となっている。ユビキチンとその関連タンパク質（SUMO、Atg8、Atg12など）は、いずれも比較的似たタンパク質ライゲーション経路を辿る傾向がある。[ 6 ]

ユビキチンおよびユビキチン様タンパク質によるタンパク質連結のプロセスには、3 つの主なステップがあります。[ 6 ]最初のステップでは、特定の活性化タンパク質 (E1 または E1 様タンパク質) がATPでユビキチンをアデニル化して活性化します。[ 6 ]次に、アデニル化されたユビキチンは、ユビキチンのC 末端グリシンのカルボキシル基と E1 システインの硫黄との間のチオエステル結合を使用して、保存されたシステインに転移されます。[ 6 ] [ 14 ] [ 8 ]次に、活性化 E1 酵素はユビキチンに結合して次の層である E2 酵素に転送し、E2 酵素がタンパク質を受け入れて、再び保存された結合でチオエステルを形成します。 E2はある程度の仲介役として働き、最終段階ではE3酵素リガーゼに結合し、最終的にユビキチンまたはユビキチン関連タンパク質を標的タンパク質のリジン部位に転移させるか、より一般的にはユビキチン自体に転移させて、そのタンパク質の鎖を形成する。[ 14 ]

しかし、最終段階では、E3リガーゼの種類によっては、実際には結合を引き起こしていない可能性があるという相違点もあります。HECTドメインを含むE3リガーゼは、別の保存されたシステインを介してユビキチンを再び受け入れ、それを標的として目的の標的に転移することで、この「転移連鎖」を継続します。一方、亜鉛イオンとの配位結合を利用して構造を安定化させるRINGフィンガードメインを含むリガーゼは、反応を誘導する役割がより強くなります。つまり、RINGフィンガーE3リガーゼがユビキチンを含むE2に結合すると、それは単に標的タンパク質のリジン部位に直接ライゲーションするようにE2を誘導する標的装置として機能するということです。[ 14 ] [ 15 ]

この場合、ユビキチンはそれと関連する他のタンパク質をよく代表していますが、各タンパク質には、SUMOなどの独自の厄介な点があることは明らかです。SUMOはRINGフィンガードメインリガーゼである傾向があり、E3は単にE2によるライゲーションを指示する標的デバイスとして機能し、ユビキチンE3-HECTリガーゼのように実際に反応自体を実行することはありません。[ 8 ]したがって、タンパク質が転送チェーンに参加する方法などの内部メカニズムは異なりますが、標的化にチオエステルや特定のリガーゼを使用するなどの一般的な化学的側面は同じままです。

生体構造

構造目的のイソペプチド形成に関わる酵素化学は、ユビキチンおよびユビキチン関連タンパク質の場合とは異なります。これは、複数の酵素が基質を活性化、結合、標的化するという一連のステップではなく、ユビキチンの場合に見られる反応とは異なります。[ 16 ]触媒は1つの酵素によって行われ、前駆段階として存在するのは、もしあるとすれば、通常は酵素前駆体からの切断による活性化のみです。しかし、ユビキチンの場合に見られる均一性は、イソペプチド結合形成反応に関わる多数の異なる酵素によって異なるため、ここでは当てはまりません。

最初の例はソルターゼです。ソルターゼは、多くのグラム陽性細菌に広く分布する酵素ファミリーです。ソルターゼは重要な病原性因子および毒性因子であることが示されています。ソルターゼが行う一般的な反応は、独自の「触媒三元構造」、すなわちヒスチジン、アルギニン、システインを反応機構として用いるものです。ヒスチジンとアルギニンは反応環境を作り出すのに役立ち、システインが再び反応中心として働きます。チオエステルはカルボキシル基を保持することで、リジンのアミンが求核攻撃を行い、タンパク質を転移させてイソペプチド結合を形成できるようにします。酵素反応において間接的ではあるものの重要な役割を果たすイオンとして、ソルターゼに結合するカルシウムが挙げられます。カルシウムは、酵素の構造を触媒作用に最適な構造に保つ上で重要な役割を果たします。しかしながら、カルシウムが触媒作用に必須ではないことが示されているケースもあります。[ 17 ]

ソルターゼを一般的に特徴づけるもう一つの特徴は、基質に対して非常に特異的な標的指向性を持つことです。ソルターゼは一般的に2つの機能を持ち、1つ目は細菌の細胞壁へのタンパク質の融合、2つ目はピリンの重合です。タンパク質を細胞壁に局在させるプロセスには、タンパク質が疎水性ドメイン、正に帯電した末端領域、そして認識に用いられる最終的な特異的配列を含むという3つの要件があります。[ 12 ]これらのシグナルの中で最もよく研​​究されているのはLPXTGで、これは切断点として機能し、ソルターゼはここでThrとGlyの間を攻撃し、Thrのカルボキシル基と共役します。[ 17 ]次に、チオエステルはペプチドを第一級アミンに転移することによって分解されますが、これは通常非常に高い特異性を持ち、B. cereusの例では、ソルターゼD酵素が2つの認識シグナル、切断およびチオエステル形成点としてのLPXTGと、イソペプチドが形成される場所としての認識シグナルとして機能するYPKN部位を介してBcpAタンパク質の重合を助けます。[ 18 ]詳細は細菌間で異なる場合がありますが、ソルターゼ酵素化学の基本は同じです。

次の例はトランスグルタミナーゼ（TGase）で、これは主に真核生物内で、創傷治癒や脂質膜へのタンパク質の付着など様々な理由で異なるタンパク質を融合するために作用する。[ 19 ] [ 20 ] TGase自体にも、ヒスチジン、アスパラギン酸、システインからなる独自の「触媒トライアド」が含まれる。これらの残基の役割は、前述のソルターゼと類似または同じであり、ヒスチジンとアスパラギン酸は標的残基との相互作用において補助的な役割を果たし、システインがカルボキシル基とチオエステルを形成して、この場合はリジンに対する関心により、後の一級アミンによる求核攻撃を受ける。ソルターゼとの触媒的な類似点はそこで終わるが、酵素とファミリーはカルシウムに依存しており、カルシウムは酵素の堅固な構造を保持する上で重要な構造的役割を果たす。 TGaseは、Gln-Gln-Val配列の中央のGlnを特異的に標的とする点で、非常に異なる基質特異性を持っています。一般的な基質特異性、すなわち特定のタンパク質は、異なるTGaseの一般的な構造に起因しており、それによって基質に標的が絞られます。[ 19 ]

TGasesには特異性が認められており、異なるTGasesは同じタンパク質上の異なるGlnに反応し、酵素が非常に特異的な初期標的を持っていることを示しています。[ 21 ]また、どの標的リジンにタンパク質を転移するかについても、ある程度の特異性があることが示されており、第XIII因子の場合、Lysに隣接する残基が反応が起こるかどうかを決定します。[ 20 ]したがって、TGasesは最初は真核生物のソルターゼのように見えるかもしれませんが、別々の酵素セットとして独立しています。

構造上の目的におけるイソペプチド結合酵素のもう一つの例は、コレラ菌によって生成されるMARTX毒素タンパク質のアクチン架橋ドメイン（ACD）である。ACDは触媒作用を行う際にマグネシウムとATPを用いて架橋を形成することが示されているが、そのメカニズムの詳細は不明である。この場合に形成される架橋の興味深い点は、イソペプチド結合を形成する過程では稀と思われる非末端グルタミン酸を非末端リジンに連結することである。[ 13 ] ACDの化学的性質はまだ解明されていないが、タンパク質間の非末端イソペプチド結合の形成は、単にアスパラギン酸/アスパラギン酸に依存するのではないことを示している。

最後に検討するケースは、興味深いマイクロチューブリン（MT）の翻訳後修飾のケースである。MTには多様な翻訳後修飾が含まれるが、最も関心を集めているのはポリグルタミル化とポリグリシル化の2つである。どちらの修飾も、MTのC末端領域にあるグルタミン酸の側鎖カルボキシル基に融合した同じアミノ酸の繰り返し領域であるという点で類似している。ポリグリコシル化酵素についてはあまり知られていないため、酵素のメカニズムは十分に解明されていない。ポリグルタミル化の場合も正確なメカニズムは不明であるが、ATP依存的であると思われる。[ 22 ]酵素化学に関してはここでも明確さが欠けているが、グルタミン酸のR基カルボキシル基と修飾ペプチドのN末端アミノ基を組み合わせてイソペプチド結合を形成するという貴重な知見が依然として得られている。

アプリケーション

自発的なイソペプチド結合形成は、 SpyTagと呼ばれるペプチドタグの開発に利用されています。SpyTagは、結合パートナー（SpyCatcherと呼ばれるタンパク質）とイソペプチド共有結合を介して自発的かつ不可逆的に反応することができます。[ 23 ]この分子ツールは、生体内タンパク質標的化、蛍光顕微鏡検査、タンパク質マイクロアレイへの不可逆的な結合などに応用できる可能性があります。これに続き、SpyTag/SpyCatcherを補完するSnoopTag/SnoopCatcher [ 24 ]やSdyTag/SdyCatcher [ 25 ]などの他のタグ/キャッチャーシステムが開発されました。

参照

参考文献

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