生きた単一細胞イメージング

システム生物学において、生細胞イメージングは​​、従来の生細胞イメージングとタイムラプス顕微鏡技術に自動細胞追跡および特徴抽出を組み合わせた生細胞イメージング技術であり、ハイコンテントスクリーニングの多くの技術を応用しています。これは、個々の生細胞集団におけるシグナル伝達のダイナミクスと挙動を研究するために使用されます。[ 1 ] [ 2 ]生細胞研究は、ウェスタンブロットなどの集団平均化実験では明らかにならない重要な挙動を明らかにすることができます。[ 3 ]

生細胞イメージング実験では、蛍光レポーターを細胞株に導入し、シグナル伝達分子のレベル、局在、または活性を測定します。その後、細胞集団を、生存率を維持し、細胞へのストレスを軽減するために、慎重に大気を制御しながら、経時的にイメージングします。これらの時系列画像に対して自動細胞トラッキングを実行し、フィルタリングと品質管理を実施します。蛍光レポーターを経時的に特徴づける特徴を解析することで、モデル化と生物学的結論の導出が可能となり、さらなる実験の指針となります。

歴史

生きた単一細胞イメージングの分野は、オワンクラゲに見られる緑色蛍光タンパク質（GFP）が生体内で発現できることを実証した研究から始まりました。[ 4 ]この発見により、研究者は生きた単一細胞内のタンパク質の局在とレベル、例えばキナーゼの活性[ 5 ]やカルシウム濃度をFRETレポーター[ 6 ]の使用を通じて研究できるようになり、その他多数の表現型も研究できるようになりました。 [ 7 ]

一般的に、これらの初期の研究は、蛍光標識されたタンパク質の細胞内レベルでの短期間の局在と挙動に焦点を当てていました。しかし、腫瘍抑制因子p53 [ 8 ]とストレスおよび炎症関連タンパク質NF-κB [ 9 ]を研究する先駆的な研究により、これらのタンパク質のレベルと局在がそれぞれ数時間にわたって振動することが明らかになり、状況は変化しました。この頃、生きた単細胞生物におけるシグナル伝達を理解するために、生きた単細胞アプローチも適用されました。細菌では生きた研究によってコンピテンスのダイナミクスをモデル化することができ、[ 10 ]酵母では一貫した細胞周期への移行を支えるメカニズムが明らかになりました。[ 11 ]

実験ワークフロー

蛍光レポーター

あらゆる生細胞研究において、最初のステップは、対象となるタンパク質／分子のレポーターを適切な細胞株に導入することです。この分野の成長の多くは、CRISPRなどの遺伝子編集ツールの改良によるものであり、これにより多種多様な蛍光レポーターが開発されました。[ 12 ]

蛍光タグ付けでは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、タグ付けするタンパク質のコーディングフレームに挿入します。タグ付けされたタンパク質の画像から、テクスチャと強度の特徴を抽出することができます。

分子はin vitroで標識され、電気泳動によって細胞に導入される。これにより、より小型で光安定性の高い蛍光色素の使用が可能になるが、追加の洗浄工程が必要となる。[ 13 ]

FRETレポーターの発現を改変することで、上流シグナル分子が活性または不活性の場合にのみドナー蛍光体とエミッター蛍光体が近接するようにすれば、ドナー対エミッター蛍光強度比をシグナル伝達活性の指標として用いることができます。例えば、FRETレポーターを生体単一細胞研究に用いた初期の重要な研究では、Rho GTPase活性のFRETレポーターが改変されました。[ 14 ]

核転座レポーターは、シグナル伝達分子によって阻害される可能性のある、改変された核輸入および核輸出シグナルを使用して、核レポーターと細胞質レポーターの比率を介してシグナル伝達活性を記録する。[ 15 ]

ライブイメージング

次に、蛍光標識された細胞の生細胞イメージングを実施する必要があります。そのためには、イメージングを実施しながら、細胞をストレスフリーな条件下で同時にインキュベートする必要があります。イメージング条件を選択する際には、光毒性、光退色、トラッキングの容易さ、シグナル伝達活性の変化率、S/N比など、考慮すべきいくつかの要素があります。これらはすべて、イメージング周波数と照明強度に関連しています。

光毒性は、長期間にわたり大量の光に曝露されることで発生する可能性があります。細胞はストレスを受け、アポトーシスにつながる可能性があります。高頻度かつ高強度のイメージングは​​、光退色によって蛍光色素のシグナルを減少させる可能性があります。一般的に、高頻度のイメージングは​​自動細胞追跡を容易にします。イメージング周波数は、シグナル伝達活性における必要な変化を捉えられるものでなければなりません。低強度のイメージングやレポーターの性能が悪いと、細胞内の低レベルのシグナル伝達活性を検出できない可能性があります。

生細胞追跡

生細胞イメージングの後、自動追跡ソフトウェアを用いて細胞の動画から時系列データを抽出します。生細胞追跡は一般的に、細胞または核の画像セグメンテーションと、これらのセグメントに基づく細胞／核追跡という2つの段階に分かれています。生細胞イメージング研究のこの段階では、依然として多くの課題が残っています。[ 16 ]しかし、近年の進歩により、この分野では、単一細胞追跡技術の客観的な比較が初めて実施されました。[ 17 ]

定量位相イメージング（QPI）は、生細胞追跡に特に有用です。QPIはラベルフリーであるため、光毒性を誘発せず、蛍光イメージングに伴う光退色も発生しません。[ 18 ] QPIは、位相差顕微鏡などの従来の位相イメージング技術よりもはるかに高いコントラストを提供します。この高いコントラストにより、従来の位相イメージングよりも堅牢な細胞セグメンテーションと追跡が可能になります。[ 19 ]

従来の画像セグメンテーション技術とディープラーニングを組み合わせて細胞をセグメンテーションする新しい技術も広く使用されるようになってきています。[ 20 ]

データ分析

生きた単一細胞イメージング研究の最終段階では、追跡された細胞から抽出された時系列データのモデリングと解析が行われます。家系図プロファイルを作成することで、個々の細胞の応答と下流のシグナル伝達における異質性を明らかにすることができます。[ 21 ] [ 22 ]ビデオベースの単一細胞追跡から得られたデータを精製および圧縮することで、ビッグデータ分析に関連する入力が得られ、診断と予後の向上に役立つバイオマーカーの特定に貢献できます。[ 23 ]単一細胞ライブデータの解析と、常微分方程式を用いた生物システムのモデリングの間には大きな重複があります。この重要なデータ分析ステップの結果は、例えば研究対象のシステムの側面に摂動を与え、シグナル伝達のダイナミクスを対照群のダイナミクスと比較するなど、さらなる実験を推進します。

アプリケーション

生きた単一細胞研究は、集団全体にわたる単一細胞のシグナル伝達ダイナミクスを分析することにより、これらのダイナミクスが主要な細胞意思決定プロセスにどのように影響するかを理解できるようになってきました。たとえば、成長因子ERKの生きた単一細胞研究では、それがデジタルの全か無かの活性化を持つことが明らかになりました。[ 24 ]さらに、この全か無かの活性化はパルス状であり、パルスの頻度によって、哺乳類細胞が細胞周期に入るかどうかが決定されました。もう 1 つの重要な例として、哺乳類細胞のCDK2活性の生きた単一細胞研究では、有糸分裂後の CDK2 活性の分岐によって、細胞が増殖し続けるか、静止状態に入るかが決定されました。[ 25 ]現在では、生きた単一細胞法を使用して、CDK2 活性を阻害するp21の上方制御を誘導する確率的な DNA 損傷によって引き起こされることが示されています。[ 26 ]今後、生きた単一細胞研究では、複雑な意思決定プロセスを理解できるようにするために、複数のレポーターを単一細胞株に組み込むことが考えられますが、生きた単一細胞研究の規模拡大には依然として課題が残っています。

参考文献

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