溶解バッファー
分子生物学における細胞破壊用緩衝液

溶解緩衝液は、細胞内の不安定な高分子を分析する分子生物学実験（例：タンパク質のウェスタンブロット、 DNA抽出）において、細胞を破砕する目的で用いられる緩衝液である。ほとんどの溶解緩衝液には、緩衝塩（例：トリス-HCl）とイオン塩（例：NaCl ）が含まれており、溶解液のpHと浸透圧を調節する。膜構造を破壊するために界面活性剤（トリトンX-100やSDSなど）が添加されることもある。タンパク質抽出を目的とした溶解緩衝液には、プロテアーゼ阻害剤が含まれることが多く、困難な場合には必須となることもある。溶解緩衝液は、動物組織細胞と植物組織細胞の両方に使用することができる。[1]

バッファの選択

溶解バッファーの主な目的は、目的の分子を分離し、安定した環境に保つことです。タンパク質の場合、いくつかの実験では標的タンパク質を完全に変性させる必要がありますが、他のいくつかの実験では標的タンパク質は折り畳まれたまま機能する必要があります。異なるタンパク質はまた異なる特性を持ち、異なる細胞環境に存在します。したがって、実験の目的と設計に基づいて最適なバッファーを選択することが不可欠です。考慮すべき重要な要素は、pH、イオン強度、界面活性剤の使用、タンパク質分解プロセスを防ぐためのプロテアーゼ阻害剤です。[2]たとえば、グラム陰性細菌を溶解するときは界面活性剤の添加が必要ですが、グラム陽性細菌には必要ありません。[3] リン酸化タンパク質を研究するときは、ホスファターゼ阻害剤などの他の酵素阻害剤とともにプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーに追加するのが一般的です。

コンポーネント

バッファ

緩衝液は、単離されたタンパク質のための環境を作り出します。それぞれの緩衝液には特定のpH範囲があるため、実験の標的タンパク質が特定のpH下で安定しているかどうかに基づいて緩衝液を選択する必要があります。また、同様のpH範囲の緩衝液を選択する場合は、その緩衝液が実験の標的タンパク質と適合するかどうかを考慮することが重要です。[4]以下の表は、最も一般的に使用される緩衝液とそのpH範囲を示しています。[4]

バッファ pH範囲
リン酸二水素ナトリウム 5.8 - 8.0
トリス-HCl 7.0～9.0
ヘペス - NaOH 7.2 - 8.2

添加剤

塩

溶解緩衝液には通常、1種類以上の塩が含まれています。溶解緩衝液中の塩の機能は、緩衝液中のイオン強度を確立することです。最も一般的に使用される塩としては、NaCl、KCl、(NH 4 ) 2 SO 4などが挙げられます。これらの塩は通常、50～150 mMの濃度で使用されます。[4]

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の構造

洗剤

トリトンX-100の構造

界面活性剤は、有機両親媒性（疎水性の尾部と親水性の頭部を持つ）界面活性剤です。界面活性剤の疎水性部分が生体膜を包み込み、膜タンパク質を膜から分離するため、膜タンパク質を膜から分離するために使用されます。[5]界面活性剤は広く使用されており、同様の機能を有していますが、実験の目的に照らして、対象となる界面活性剤の物理的および化学的性質を考慮する必要があります。

洗剤は、親水性ヘッドグループの特徴に基づいて、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性イオン性に分類されることが多い。[5]

トリトンX-100のような非イオン性界面活性剤やCHAPS（3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニウム]-1-プロパンスルホネート）のような両性イオン性界面活性剤は非変性性（タンパク質の機能を阻害しない）です。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のようなイオン性界面活性剤やエチルトリメチルアンモニウムブロミドのような陽イオン性界面活性剤は変性性（タンパク質の機能を阻害する）です。[6]界面活性剤は、特定の溶解バッファーの溶解強度を決定する主要な成分です。

界面活性剤を含まない細胞溶解バッファー

多くの細胞溶解バッファーが直面する共通の問題の一つは、溶解プロセス中のタンパク質構造の破壊であり、これは界面活性剤の使用が一因となっています。界面活性剤は、適切なタンパク質フォールディングに必要な本来の状態への回復を妨げることがよくあります。[7]

長い間、界面活性剤を用いた細胞溶解の後には、緩衝液交換や透析を行って界面活性剤やその他の阻害化合物を除去し、本来の状態に戻す必要がありました。[8]

この問題を克服するために、界面活性剤を含まない細胞溶解バッファーという解決策が生まれました。GentleLysバッファーは界面活性剤の代わりに共重合体を使用することで、タンパク質などの細胞成分の正しいフォールディングに不可欠な本来の環境を維持しながら、効率的な細胞溶解を実現します。

その他

その他の添加物としては、金属イオン、グルコース、グリセロールなどの糖、金属キレート剤（例：EDTA）、ジチオトレイトール（DTT）などの還元剤などがある。[4]

よく使われるバッファ

NP-40溶解バッファー

おそらく最も広く使用されている溶解緩衝液です。可溶化剤はNP-40ですが、濃度を変えれば他の界面活性剤に置き換えることができます。NP-40は非イオン性界面活性剤であるため、この溶解緩衝液はRIPA緩衝液よりも穏やかな作用を示します。タンパク質の機能を保持しつつ、最小限の破壊でタンパク質の機能を維持する必要がある場合に使用できます。[9]

レシピ: [9]

  • 150 mM NaCl
  • 1.0% ノニデットP-40またはトリトンX-100
  • 50 mM トリス-Cl
  • pHを7.4に調整する

RIPA（放射免疫沈降アッセイ）溶解バッファー

RIPA緩衝液は、免疫沈降法や細胞・組織からの一般的なタンパク質抽出に広く用いられる溶解緩衝液です。この緩衝液は、バナデートを添加しない場合、4℃で最大1年間保存できます。[10] RIPA緩衝液は、細胞からタンパク質を遊離させるだけでなく、タンパク質間の弱い相互作用のほとんどを阻害します。[9]

レシピ: [10]

  • 1% (w/w) ノニデットP-40 (NP-40)
  • 1%（w/v）デオキシコール酸ナトリウム
  • 0.1% (w/v) SDS
  • 0.15 M NaCl
  • 0.01 Mリン酸ナトリウム、pH 7.2
  • 2 mM EDTA
  • 50 mM フッ化ナトリウム（NaF）
  • 0.2 mMの新鮮なオルトバナジン酸ナトリウム（Na 3 VO 4 .2H 2 O、リン酸を模倣するためホスファターゼ阻害剤機能を有する）
  • 100 U/ml プロテアーゼ阻害剤（アプロチニンなど）

SDS（​​ドデシル硫酸ナトリウム）溶解緩衝液

SDSはイオン性変性界面活性剤です。タンパク質を完全に溶解・変性させる必要がある場合は、加熱SDS緩衝液がよく使用されます。

レシピ: [10]

  • 0.5% (w/v) SDS
  • 0.05 M トリス⋅Cl
  • pHを8.0に調整する
  • 1 mMの新鮮なジチオトレイトール（DTT）を加える

ACK（塩化アンモニウムカリウム）溶解緩衝液

ACKは、白血球などの他の細胞がより重要である生物学的サンプル中の赤血球の溶解に使用されます。 [11]

レシピ: [12] [13]

GentleLys（ジェントルライシス）

GentleLysバッファーは、合成ナノディスク共重合体を用いて細胞膜を穏やかに破壊することで、従来の界面活性剤ベースの溶解バッファーよりも穏やかな代替手段を提供します。この穏やかなアプローチは、有害な化学物質の使用を必要とせず、細胞タンパク質の本来の状態を維持する環境を作り出します。その結果、タンパク質は構造的完全性と機能性を維持し、界面活性剤ベースのバッファーによる変性効果とは大きく異なります。

洗剤、塩、酵素

細胞溶解は、細菌細胞からの酵素精製において重要なステップです。効果的な細胞破壊と標的酵素の放出を促進するために、溶解バッファーには様々な成分が一般的に含まれています。これらの成分には、界面活性剤、塩、酵素などがあり、それぞれが溶解プロセスにおいて特定の役割を果たします。溶解バッファーに使用される界面活性剤の例としては、以下のものがあります。

洗剤:

界面活性剤は、親水性と疎水性の両方の性質を持つ両親媒性分子です。細胞溶解において、界面活性剤は細菌細胞膜の脂質二重層を破壊することで作用し、膜透過性を高め、標的酵素を含む細胞内成分を放出します。

溶解バッファーによく使用される洗剤には以下のものがあります。

a.トリトン X-100 : 穏やかで効果的な膜破壊特性を持つため頻繁に使用される非イオン性洗剤で、脂質と膜タンパク質を可溶化し、細胞内内容物の放出を可能にします。

b.ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）：タンパク質の二次構造と三次構造を破壊することでタンパク質を変性させる陰イオン界面活性剤で、細胞膜を可溶化し、タンパク質の抽出を助けます。

c. Tween-20：非イオン性界面活性剤で、SDSやTriton X-100に比べて穏やかな性質を持ちます。タンパク質の膜透過性と可溶化を促進しますが、著しい変性は引き起こしません。

塩:

塩は、最適な細胞状態を維持し、イオン強度を提供して細胞破壊を促進するため、溶解バッファーの重要な成分です。

溶解緩衝液によく使用される塩には以下のものがあります。

a.塩化ナトリウム(NaCl): 溶解プロセス中に浸透圧ショックや細胞破裂を防ぎ、等張状態を維持するために、NaCl が含まれることがよくあります。

b.塩化カリウム(KCl): NaCl と同様に、KCl はイオン強度を調整し、細胞溶解を促進するために使用できます。

酵素:

特定の酵素を溶解バッファーに添加して、標的酵素の抽出を妨げる可能性のある特定の細胞成分を消化することで細胞溶解を強化します。

溶解バッファーに使用される酵素の例は次のとおりです。

a. リゾチーム：リゾチームは細菌細胞壁のペプチドグリカン層を分解し、その構造的完全性を弱め、その後の破壊を促進します。特にグラム陽性細菌に有効です。

b. DNase（デオキシリボヌクレアーゼ）：DNase は溶解液中に存在する DNA を分解し、その粘度を低下させて、下流の精製ステップにおける DNA 関連の干渉を防ぎます。

c. RNase（リボヌクレアーゼ）：DNaseと同様に、RNaseは溶解液中のRNAを分解し、その粘度を低下させ、RNA関連の干渉を最小限に抑えます。

溶解バッファー内の洗剤、塩、酵素の具体的な組み合わせと濃度は、標的酵素、細胞の種類、実験要件に応じて変化する可能性があります。これらの成分の最適化は、精製プロセス中に目的の酵素の安定性と活性を維持しながら効率的な細胞溶解を実現するために重要です。

DNAおよびRNA研究における溶解バッファー

DNAフィンガープリンティングなどの研究では、溶解バッファーがDNAの単離に用いられます。食器用洗剤は、必要に応じて細胞膜と核膜を分解し、DNAを遊離させるのに使用できます。他に、Qiagen社が特許を保有するBuffer P2などの溶解バッファーも使用できます。

参考文献

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  2. ^ Peach, Mandy; Marsh, Noelle; Miskiewicz, EwaI.; MacPhee, DanielJ. (2015-01-01). 「タンパク質の可溶化：溶解バッファー選択の重要性」. Kurien, Biji T.; Scofield, R. Hal (編).ウェスタンブロッティング. Methods in Molecular Biology. Vol. 1312. Springer New York. pp.  49– 60. doi :10.1007/978-1-4939-2694-7_8. ISBN 978-1-4939-2693-0. PMID  26043989。
  3. ^ ポッシュ、アントン（2008年）「2D PAGE：サンプル調製と分画」ヒューマナ・プレス、24頁。ISBN 978-1-58829-722-8。
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  5. ^ ab Linke, Dirk (2009-01-01). 「第34章 界面活性剤：概要」. Richard R. Burgess; Murray P. Deutscher (編).タンパク質精製ガイド 第2版. Methods in Enzymology. Vol. 463. pp.  603– 617. doi :10.1016/s0076-6879(09)63034-2. ISBN 978-0-12-374536-1. PMID  19892194。
  6. ^ 「細胞溶解およびタンパク質抽出のための洗剤」www.thermofisher.com . 2016年3月16日閲覧。
  7. ^ Shehadul Islam, Mohammed; Aryasomayajula, Aditya; Selvaganapathy, Ponnambalam Ravi (2017年3月). 「マクロスケールおよびマイクロスケールの細胞溶解法に関するレビュー」. Micromachines . 8 (3): 83. doi : 10.3390/mi8030083 . ISSN  2072-666X. PMC 6190294 . 
  8. ^ Brown, Robert B; Audet, Julie (2008-10-06). 「単一細胞溶解のための最新技術」. Journal of the Royal Society Interface . 5 (suppl_2): S131-8. Bibcode :2008JRSI....5focusB. doi :10.1098/rsif.2008.0009.focus. ISSN  1742-5689. PMC 2504493. PMID 18426769  . 
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  10. ^ abc Sefton, Bartholomew M. (2001-01-01). 「培養細胞の32Pi標識と免疫沈降のための細胞溶解液の調製」.培養細胞の32Pi標識と免疫沈降のための細胞溶解液の調製. 第18巻. John Wiley & Sons, Inc. pp. Unit 18.2. doi :10.1002/0471142727.mb1802s40. ISBN 978-0-471-14272-0. PMID  18265167. S2CID  20969356. {{cite book}}:|journal=無視されました (ヘルプ)
  11. ^ ACK溶解バッファー
  12. ^ 「ACK溶解バッファー」 . Cold Spring Harbor Protocols . 2014 (11) pdb.rec083295. 2014. doi :10.1101/pdb.rec083295.
  13. ^ 「A10492 - ACK溶解バッファー - 米国」。
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