多座位配列タイピング

多座位配列タイピング（MLST ）は、分子生物学における複数遺伝子座のタイピング技術であり、複数のハウスキーピング遺伝子の内部断片のDNA配列を用いて、異なる種の分離株の特性を明らかにする。この技術は、他の方法では判別が難しい傾向がある微生物、主に原核生物と酵母に最もよく適用される。

最初に開発されたMLST法は、髄膜炎菌性髄膜炎および敗血症の原因菌である髄膜炎菌[ 1 ]を対象としたものでした。進化史の研究のために導入されて以来、MLST法はヒト病原体だけでなく植物病原体にも利用されてきました。[ 2 ]

原理

MLST法は、一連のハウスキーピング遺伝子におけるDNA配列変異を直接測定し、それぞれの対立遺伝子プロファイルに基づいて株を特徴づけます。MLST法の原理はシンプルで、PCR増幅とDNAシーケンシングを組み合わせた手法です。株間のヌクレオチド配列の差異は、必要な識別レベルに応じて、様々な数の遺伝子で確認できます。

MLST のワークフローは、1) データ収集、2) データ分析、3) 多座配列解析で構成されます。データ収集ステップでは、遺伝子断片のヌクレオチド配列決定によって変異の決定的な識別が得られます。データ分析ステップでは、すべての一意の配列に対立遺伝子番号が割り当てられ、対立遺伝子プロファイルに結合され、配列タイプ (ST) が割り当てられます。新しい対立遺伝子と ST が見つかった場合は、検証後にデータベースに保存されます。MLST の最終分析ステップでは、対立遺伝子プロファイルを比較することによって分離株の関連性が作成されます。研究者は、異なるクローン複合体の ST を比較することにより、疫学的および系統学的研究を行います。配列決定および識別プロセス中に膨大なデータセットが生成されるため、バイオインフォマティクス手法を使用してすべての生物学的データを整理、管理、分析、および統合します。

許容できる識別力、菌株の型別にかかる時間、コストのバランスを取るため、研究室では一般的に7～8種類のハウスキーピング遺伝子が用いられています。黄色ブドウ球菌を例に挙げると、MLST型別では7種類のハウスキーピング遺伝子が用いられています。MLSTウェブサイトに記載されているこれらの遺伝子には、カルバメートキナーゼ（arcC）、シキミ酸脱水素酵素（aroE）、グリセロールキナーゼ（glpF）、グアニル酸キナーゼ（gmk）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ pta ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpi）、アセチルコエンザイムAアセチルトランスフェラーゼ（yqiL）が含まれます。ただし、最大10種類のハウスキーピング遺伝子が用いられることも珍しくありません。ビブリオ・バルニフィカスの場合、使用されるハウスキーピング遺伝子は、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（glp）、DNAジャイレースサブユニットB（gyrB）、リンゴ酸乳酸脱水素酵素（mdh）、メチオニルtRNA合成酵素（metG）、ホスホリボシルアミノイミダゾール合成酵素（purM）、スレオニン脱水素酵素（dtdS）、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（lysA）、トランスヒドロゲナーゼαサブユニット（pntA）、ジヒドロオロターゼ（pyrC）、およびトリプトファナーゼ（tnaA）です。したがって、MLSTによって検査されるハウスキーピング遺伝子の数と種類は、種によって異なる場合があります。

これらのハウスキーピング遺伝子それぞれについて、異なる配列が対立遺伝子として割り当てられ、各遺伝子座における対立遺伝子は対立遺伝子プロファイルを提供します。一連のプロファイルは、株の分類における識別マーカーとなります。1塩基でも異なる配列は異なる対立遺伝子として割り当てられ、対立遺伝子間のヌクレオチドの差異の数を考慮した重み付けは行われません。これは、複数のヌクレオチド部位における差異が複数の点突然変異によるものか、単一の組換え交換によるものか区別できないためです。各遺伝子座における潜在的な対立遺伝子の数が多いため、数十億もの異なる対立遺伝子プロファイルを区別することが可能であり、各遺伝子座で最も一般的な対立遺伝子を持つ株は、約10,000分離株に1回程度しか偶然に出現しないと予想されます。 MLST は高い識別力を提供するにもかかわらず、ハウスキーピング遺伝子におけるヌクレオチド変化の蓄積は比較的ゆっくりとしたプロセスであり、細菌分離株の対立遺伝子プロファイルは 時間の経過とともに十分に安定しているため、この方法は世界的な疫学に最適です。

分離株の近縁性は、対立遺伝子プロファイル間の対差行列、eBURST、または最小全域木（MST）を用いて構築された樹状図として表示されます。樹状図は、同一または非常に類似した対立遺伝子プロファイルを持ち、共通の祖先に由来すると推定される分離株を表示する簡便な方法に過ぎません。7つの遺伝子座のうち3つ以上が異なる分離株間の関係は信頼性が低い可能性があり、系統発生を推測するために用いるべきではありません。[ 3 ] [ 4 ] MSTは、樹状図のすべての枝の距離の合計が最小となるようにすべてのサンプルを接続します。[ 5 ]

あるいは、分離株の関連性は、多座位配列解析（MLSA）。これは割り当てられた対立遺伝子を使用せず、ハウスキーピング遺伝子の遺伝子断片の配列を連結し、この連結された配列を使用して系統関係を決定します。MLSTとは対照的に、この解析では、1つのヌクレオチドのみが異なる配列間に高い類似性を割り当て、複数のヌクレオチドの相違がある配列間に低い類似性を割り当てます。結果として、この解析はクローン進化する生物に適しており、組換えイベントが非常に頻繁に発生する生物にはあまり適していません。また、近縁種間の系統関係を決定するためにも使用できます。[ 6 ] MLSTとMLSAという用語は非常に頻繁に交換可能であると考えられています。しかし、各解析方法には独特の特徴と用途があるため、これは正しくありません。正しい用語を使用するように注意する必要があります。

他の技術との比較

細菌分離株の鑑別には、血清学的タイピング手法が確立されていましたが、免疫学的タイピングには、少数の抗原遺伝子座への依存や、異なる抗原変異体に対する抗体の反応性が予測できないなどの欠点があります。病原体の相同性を決定するために、パルスフィールド・ゲル電気泳動（PFGE）、リボタイピング、PCRベースのフィンガープリンティングなど、いくつかの分子タイピング手法が提案されています。しかし、これらのDNAバンドに基づくサブタイピング法は、有意義な進化解析を提供しません。PFGEは多くの研究者から「ゴールドスタンダード」と考えられていますが、処理中にDNAが分解されるため（ゲル塗抹標本）、多くの株はこの手法ではタイピングできません。

MLSTのアプローチは、複数のコア代謝酵素の異なる電気泳動移動度（EM）に基づく多座酵素電気泳動（MLEE）とは異なります。酵素間のアミノ酸配列の違いがゲル上で泳動した際に異なる移動度と明確なバンドをもたらすように、各座位のアレルが産物のEMを定義します。分離株の相同性は、電気泳動型間のペアワイズ差異のマトリックスから生成された樹状図によって視覚化できます。この方法は、酵素表現型の多様性がDNA配列の多様性の代理指標に過ぎないという事実から生じるいくつかの理由により、MLSTよりも解像度が低くなります。第一に、酵素は異なるアミノ酸配列を持つ場合がありますが、明確なバンドを形成するのに十分なEMの違いはありません。第二に、「サイレント変異」は、コードされているアミノ酸を変化させることなく、遺伝子のDNA配列を変化させる可能性があります。第三に、酵素の表現型は環境条件に応じて容易に変化し、MLEE結果の再現性に悪影響を及ぼします。酵素の一般的な修飾としては、リン酸化、補因子結合、輸送配列の切断などが挙げられます。このため、異なる研究室で得られたMLEEデータの比較可能性も制限されますが、MLSTは移植性が高く比較可能なDNA配列データを提供し、自動化と標準化に大きな可能性を秘めています。

MLSTは、 DNAバーコーディングと類似しており、どちらも部分的な遺伝情報を用いて生物集団を区別しようとします。しかし、DNAバーコーディングは種間の区別を目的としており、比較的変異率の高い1つまたは2つの短い断片（例えば、mtDNAまたはrDNAの断片）を用いることを好みます。これらの断片は、通常、種間で配列に大きな差異をもたらします。そうでない場合は、複数の遺伝子座が使用されることもありますが[ 7 ]、MLSTとは異なり、焦点は種レベルに留まります[ 8 ] 。

利点と用途

MLSTは非常に明確で可搬性に優れています。ST判定に必要な材料は、研究室間で交換可能です。プライマー配列とプロトコルは電子的にアクセス可能です。再現性と拡張性にも優れています。MLSTは自動化されており、ハイスループットシーケンシングとバイオインフォマティクスの進歩と、確立された集団遺伝学技術を組み合わせています。MLSTデータは、細菌間の進化的関係を調査するために使用できます。MLSTは、分離株を区別するための優れた識別力を提供します。

MLSTの応用範囲は広く、科学、公衆衛生、獣医学の分野だけでなく、食品業界にもリソースを提供しています。以下はMLSTの応用例です。

カンピロバクター

カンピロバクターは細菌性感染性腸疾患の一般的な原因物質であり、通常は加熱不十分な家禽類や未殺菌牛乳が原因で発生します。しかし、アウトブレイクの発生はめったに確認されないため、その疫学は十分に解明されていません。そのため、アウトブレイクの発生源や感染経路の追跡は容易ではありません。さらに、カンピロバクターのゲノムは遺伝的に多様で不安定であり、ゲノム間およびゲノム内の組換えが頻繁に起こり、相変異も生じるため、多くの型別法によるデータの解釈は複雑です。最近まで、MLST技術の適用により、カンピロバクターの型別は大きな成功を収め、MLSTデータベースに追加されました。2008年5月1日現在、カンピロバクターMLSTデータベースには3516の分離株と、カンピロバクターに関する研究でMLSTを使用または言及している約30の出版物が含まれています（ http://pubmlst.org/campylobacter/）。

髄膜炎菌

MLST は、ヒト集団内およびヒト、植物、動物に病原性がある可能性のある菌株の変異体における細菌の、より豊かなテクスチャの画像を提供しました。 MLST 技術は、 6 つの遺伝子座を使用してNeisseria meningitidis を特徴付けるために、Maiden ら (1) によって初めて使用されました。 MLST の応用により、世界中で侵襲性疾患の原因であることがわかっている主要な髄膜炎菌系統が明確に解明されました。 主要な侵襲性系統間の識別力を向上させるために、現在 7 つの遺伝子座が使用されており、髄膜炎菌分離株を特徴付けるための選択方法として多くの研究室に受け入れられています。N. meningitidisでは組換え交換が一般的に発生し、髄膜炎菌クローンの急速な多様化につながることはよく知られた事実です[ 9 ]。 MLST は、クローン多様化率が一般的に低い他の細菌種内のクローンを特徴付けるための信頼性の高い方法を提供することに成功しました。

黄色ブドウ球菌

黄色ブドウ球菌（ S. aureus）は多くの疾患を引き起こします。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ MRSA）は、バンコマイシンを除くほぼ全ての抗生物質に対する耐性を示すことから、ますます懸念されています。しかしながら、地域社会における重篤なS. aureus感染症の大部分、そして病院における多くの重篤な感染症は、メチシリン感受性分離株（MSSA）によって引き起こされており、重篤な疾患に関連する強毒性MSSAクローンを同定する試みはほとんど行われていません。そこで、MRSAクローンの特性評価と、重篤な疾患に関連するMSSAクローンの同定を明確に行うために、MLSTが開発されました。

化膿レンサ球菌

S. pyogenesは、咽頭炎から壊死性筋膜炎を含む致死的な膿痂疹まで、幅広い疾患を引き起こします。S . pyogenesに対するMLSTスキームが開発されています。現在、データベース（ mlst.net） [ 10 ]には、この菌の世界的な多様性を代表する分離株のアレルプロファイルと、重篤な侵襲性疾患の分離株が含まれています。 [ 11 ]

カンジダ・アルビカンス

C. albicansはヒトの真菌性病原体であり、院内感染性血流感染症の原因となります。MLST法はC. albicans分離株の特性解析に用いられてきました。異なる遺伝子座における対立遺伝子の組み合わせにより、株の識別に使用可能な固有の二倍体配列型が得られます。MLST法は、院内におけるC. albicansの疫学研究、ならびにヒトや動物宿主を含む多様な生態学的ニッチから得られたC. albicans分離株の多様性研究に効果的に適用できることが示されています。

クロノバクター

クロノバクター属は7種から構成される。2007年以前は、これらの生物にはEnterobacter sakazakiiという単一の種名が用いられていた。16S rDNA配列決定は必ずしも正確ではなく、バイオタイピングは主観的すぎるため、クロノバクターMLSTは当初C. sakazakiiとC. malonaticusを区別するために用いられた。 [ 12 ]クロノバクターMLSTスキームは、 atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、ppsAの7つの対立遺伝子を用いて、系統解析（MLSA）と比較ゲノミクスのために3036bpの連結配列を生成する。[ 13 ] MLSTは、新しいクロノバクター種 の正式な認定にも使用されている。[ 14 ]この方法により、 1つの遺伝子系統、シーケンスタイプ4（ST4）と新生児髄膜炎の症例との間に強い関連性があることが明らかになりました。[ 15 ] Cronobacter MLSTサイトはhttp://www.pubMLST.org/cronobacterです。

制限事項

MLSTは集団遺伝学の研究に最適と思われるが、費用がかさむ。ハウスキーピング遺伝子の配列保存のため、MLSTは細菌株を区別する識別力が不足することがあり、疫学調査での使用が制限される。MLSTの識別力を改善するために、リステリア・モノサイトゲネスを用いた多毒性遺伝子座配列タイピング（MVLST）法が開発された。[ 16 ] MVLSTはMLSTの利点を広げるが、ハウスキーピング遺伝子よりも多型性が高い可能性のある毒性遺伝子を標的とする。集団遺伝学は、流行における唯一の関連要因ではない。毒性因子も疾患を引き起こす上で重要であり、集団遺伝学の研究ではこれらを監視するのが困難である。これは、関与する遺伝子が、集団遺伝学の枠組みと比較して、株間で高度に組み換えられ、移動性であることが多いためである。したがって、例えば大腸菌の場合、毒素遺伝子を持つ菌株を特定することの方が、蔓延している菌株を集団遺伝学に基づいて評価することよりも重要です。

第二世代のシーケンシング技術の登場により、比較的低コストかつ労力で細菌ゲノム全体の配列情報を取得できるようになり、MLSTが最初に開発された当時行われていたように各遺伝子座を個別にシーケンシングするのではなく、現在では全ゲノム配列情報からMLSTを割り当てることができるようになりました。[ 17 ] 全ゲノムシーケンシングは、細菌株を区別するためのより豊富な情報を提供します（MLSTはゲノム配列の約0.1％を使用してタイプを割り当て、細菌ゲノムの残りの部分は無視します）。例えば、多数の分離株の全ゲノムシーケンシングにより、クレブシエラ・ニューモニエの単一のMLST系統ST258が2つの異なる遺伝子系統で構成されていることが明らかになりました。[ 18 ]これにより、これらの多剤耐性菌の進化と拡散に関する追加情報が得られ、ST258の単一クローン起源という以前の仮説が反証されました。[ 19 ]

データベース

MLSTデータベースには、各生物の参照アレル配列と配列タイプに加え、分離された疫学データも含まれています。ウェブサイトには、ユーザーがアレル配列と配列タイプを検索できる検索・解析ソフトウェアが搭載されています。MLSTは、研究者や公衆衛生従事者のためのツールとして広く利用されています。

MLST データベースの大部分は、現在オックスフォード大学にある Web サーバー ( pubmlst.org ) でホストされています。

このサイトでホストされているデータベースには、生物固有の参照対立遺伝子配列と個々の生物の ST のリストが保存されています。

使用されたシーケンスの収集とフォーマットを支援するために、Firefox 用のシンプルで無料のプラグインが開発されました (リンクArchived 2014-02-22 at the Wayback Machine )。

参考文献

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