マイコプラズマ研究所
マイコプラズマ・ミコイデスJCVI-syn1.0
科学的分類この分類を編集する
ドメイン： 細菌
王国： バチラッティ
門: マイコプラズマ
クラス： モリクテス目
注文： マイコプラズマ目
家族： マイコプラズマ科
属: マイコプラズマ
種： M.ミコイデス
歪み： M. m. JCVI-syn1.0
三名法名
マイコプラズマ・ミコイデスJCVI-syn1.0
ギブソンら、2010年[ a 1 ]
同義語[ a 2 ]

マイコプラズマ研究所、ライヒ、2000

マイコプラズマ・ラボラトリアム（Mycoplasma laboratorium）またはシンシア（Synthia ） [ b 1 ]は、合成細菌株を作製する計画を指す。この新しい細菌を構築するプロジェクトは、発足以来、進化を続けてきた。当初の目標は、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasma genitalium）のゲノムから生命維持に必要な最小限の遺伝子セットを特定し、これらの遺伝子を合成的に再構築して「新しい」生物を創り出すことだった。マイコプラズマ・ジェニタリウムが当初このプロジェクトのベースとして選ばれたのは、当時解析対象となった生物の中で最も遺伝子数が少ないためであった。その後、焦点はマイコプラズマ・ミコイデスに移り、より試行錯誤的なアプローチが取られた。 [ b 2 ]

生命維持に必要な最小限の遺伝子を特定するため、M. genitaliumの482個の遺伝子をそれぞれ個別に欠失させ、得られた変異体の生存能を試験した。その結果、理論的には最小限のゲノムを構成する382個の遺伝子からなる最小限の遺伝子セットが特定された。[ a 3 ] 2008年には、M. genitaliumの遺伝子の完全セットが実験室で構築され、遺伝子が合成遺伝子であることを示す透かしが追加された。[ b 3 ] [ a 4 ]しかし、M. genitaliumの成長は非常に遅いため、成長に実際に必要な遺伝子セットを特定するための実験を加速させるため、 M. mycoidesが新たな研究対象として選ばれた。[ b 4 ]

2010年、 M. mycoides subsp. capri GM12の完全なゲノムをコンピュータ記録から合成し、DNAを除去したMycoplasma capricolumの既存の細胞に移植することに成功した。 [ b 5 ]このプロジェクトに使用された合成ゲノムの作製には、4,000万ドルと200人年の費用がかかったと推定されている。[ b 4 ]この新しい細菌は増殖可能であり、JCVI-syn1.0、またはSynthiaと名付けられた。機能的な生物を生成できるより小さな遺伝子セットを特定するための追加実験の後、473個の遺伝子を含むJCVI-syn3.0が生成された。[ b 2 ]これらの遺伝子のうち149個の機能は不明である。[ b 2 ] JCVI-syn3.0のゲノムは新規であるため、真の合成生物としては初めてのものと考えられている。

最小ゲノムプロジェクト

Synthia の製造は、J・クレイグ・ベンター研究所 の合成生物学の一取り組みであり、ノーベル賞受賞者のハミルトン・スミス氏を筆頭に、 DNA研究者のクレイグ・ベンター氏、微生物学者のクライド・A・ハッチソン3世氏を含む約 20 名の科学者チームによって行われている。全体的な目標は、生物をその必須要素にまで削減し、新しい生物をゼロから構築するために何が必要かを理解することです。[ a 3 ] 当初の焦点は、M. ジェニタリウムという細菌でした。これは、ゲノムが1 本の環状染色体上に配置された582,970塩基対からなる482 個の遺伝子から成る絶対細胞内寄生生物です (プロジェクト開始当時、これは自由培養できる既知の自然生物の最小のゲノムでした)。研究者らは、トランスポゾン突然変異誘発を利用して生物の成長に必須でない遺伝子を特定し、最小限の 382 個の遺伝子セットを導きました。[ a 3 ]この取り組みは最小ゲノムプロジェクトとして知られていました。[ a 5 ]

生物の選択

マイコプラズマ

マイコプラズマは、マイコプラズマ門（旧テネリクテス門）モリクテス綱に属する細菌の属であり、寄生性または片利共生性のため細胞壁を持たず（グラム陰性）特徴とする。分子生物学において、マイコプラズマ属は、哺乳類細胞培養において根絶が極めて困難な汚染物質として悪名高いこと（ β-ラクタム系抗生物質などの抗生物質に対して耐性）[ a 6 ]と、ゲノムサイズが小さいことからモデル生物として利用できる可能性を秘めていることから、大きな注目を集めている。[ a 7 ]

1996年、アルカディ・ムシェギアンとユージン・クーニンは、 M. genitaliumと別の小さな細菌であるインフルエンザ菌を比較した後、生存に必要な最小限の遺伝子セットである可能性のある256個の共通遺伝子セットが存在すると提唱しました。[ b 6 ] [ a 8 ]

シンシアプロジェクトにおける属の選択は、カール・ライヒがMycoplasma laboratoriumという語を作り出した2000年に遡る。[ a 2 ]

小さなゲノムを持つ他の生物

2005年現在、ペラギバクター・ユビキ（リケッチア目α-プロテオバクテリア）は、自由生物の中で最も小さいゲノム（1,308,759塩基対）を有し、自己複製細胞としても最小の部類に入る。おそらく世界で最も数が多い細菌（おそらく10の28乗個）であり、SAR11系統群の他の種と合わせて、海洋に生息する細菌または古細菌の細胞の4分の1から半分を占めると推定されている。 [ a 9 ] rRNA配列によって2002年に特定され、2005年に全配列が解読された。[ a 10 ]実験室培養で高い増殖密度に達しない種を培養することは極めて困難である。[ a 11 ] [ a 12 ] 新たに発見されたいくつかの種はM. genitaliumよりも遺伝子数が少ないが、自由生活性ではない。セミの共生生物であるHodgkinia cicadicola、Sulcia muelleri、 Baumannia cicadellinicola、エノキ葉柄虫こぶキジラミPachypsylla venusta [ a 13 ]の共生生物であるCarsonella ruddiには欠けている多くの必須遺伝子が、宿主の核にコードされている可能性がある。[ a 14 ] 2013年の時点で、遺伝子セットが最も少ない生物は、絶対共生生物であるNasuia deltocephalinicolaである。この生物はわずか137個の遺伝子を持ち、ゲノムサイズは112 kbである。[ a 15 ] [ b 7 ]

種名 遺伝子の数 サイズ（Mbp）
カンジダトゥスホジキニア シカディコラセム[1]169 0.14
Candidatus Carsonella ruddii PV [2]182 0.16
Candidatus Sulcia muelleri GWSS [3]227 0.25
カンジダトゥス スルシア ムレリSMDSEM [4]242 0.28
ブフネラ アフィディコラstr.シナラセドリ[5]357 0.4261
マイコプラズマ・ジェニタリウムG37 [6]475 0.58
カンジダトゥスファイトプラズマ マリ[7]479 0.6
ブフネラ アフィディコラstr.バイゾンギア・ピスタシアエ[8]504 0.6224
ナノアーキウム・エクイタンスKin4-M [9]540 0.49

テクニック

このプロジェクトでは、非常に大きな DNA 片の合成と操作が必要であったため、いくつかの実験技術を開発または適応させる必要がありました。

細菌ゲノム移植

2007年、ベンターのチームは、以下の方法でマイコプラズマ・ミコイデス種の染色体をマイコプラズマ・カプリコルムに移すことに成功したと報告した。

  • M. mycoidesのゲノムを分離します。寒天に閉じ込められた細胞を穏やかに溶解し（溶かした寒天を細胞と混ぜてゲルを形成）、次にパルスフィールドゲル電気泳動を行って正しいサイズのバンド（円形 1.25Mbp）を分離します。
  • M. capricolumの受容細胞をコンピテントにすること: 栄養培地で増殖させた後に貧弱な培地で飢餓状態にすることで、ヌクレオチド飢餓により DNA 複製が阻害され、形態が変化する。
  • ポリエチレングリコールを介した環状染色体のDNAフリー細胞への形質転換とそれに続く選択。[ a 16 ]

形質転換という用語は、ベクターを細菌細胞に挿入すること（電気穿孔法または熱ショック法による）を指します。ここでの「移植」は、核移植と同義です。

細菌の染色体合成

2008年にベンターらの研究グループは、階層的戦略を用いてM. genitalium G37配列L43967のコピーである合成ゲノムを作製したと報告した。 [ a 17 ]

  • 合成 → 1kbp: ゲノム配列は、Blue Heronによって、 80bp のオーバーラップとNotI制限部位 (非効率的だが頻度の低いカッター)を含む 1,078 個の 1080bp カセットで合成されました。
  • ライゲーション → 10kbp: 10 個の連続カセットのシリーズの 109 グループがライゲーションされ、大腸菌のプラスミドにクローニングされ、正しい順列がシーケンスによって確認されました。
  • マルチプレックス PCR → 100kbp: 連続する 10kbp アセンブリ 10 個 (酵母で増殖) の 11 グループを、各 10kbp アセンブリごとにプライマー ペアを使用して、マルチプレックス PCR によって結合しました。
  • 分離と組み換え → 二次アセンブリが分離され、結合され、ベクター配列のない酵母スフェロプラストに形質転換されました (アセンブリ 811-900 に存在)。

2008年に発表されたこの成果であるM. genitalium JCVI-1.0のゲノムは、GenBankにCP001621.1として公開されています。これは、 M. mycoidesをベースとした、後にJCVI-synと名付けられた合成生物と混同しないように注意する必要があります。[ a 17 ]

合成ゲノム

2010年、ベンターらは合成ゲノムを用いてマイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）JCVI-syn1.0株を作製した[ a 1 ] 。当初、この合成コンストラクトは機能しなかったため、プロジェクト全体に3ヶ月の遅延を引き起こした[ b 4 ]原因を特定するために、一連の半合成コンストラクトが作製された。失敗の原因は、複製開始因子であるDnaAにおける単一のフレームシフト変異であった[ a 1 ]。

合成ゲノムを持つ細胞を構築する目的は、将来的に改変ゲノムを作成するためのステップとして、この手法を検証することだった。天然ゲノムを鋳型として使用することで、潜在的な失敗要因を最小限に抑えることができた。酵母で作製された8つのセグメントをつなぎ合わせてゲノムを形成した。マイコプラズマ・ミコイデスJCVI-syn1.0には、参照ゲノムと比較していくつかの違いがあり、特に大腸菌トランスポゾンIS1（10kb段階からの感染）と85bpの重複、そして酵母での増殖に必要な要素と制限酵素部位の残基が顕著である。[ a 1 ]

JCVI-syn1.0が真の合成生物であるかどうかについては議論がある。ゲノムは化学的に多くの断片に合成されたものの、親ゲノムと厳密に一致するように構築され、天然細胞の細胞質に移植された。DNAだけでは生存細胞を作ることはできない。DNAを読み取るにはタンパク質とRNAが必要であり、DNAと細胞質を区画化するには脂質膜が必要である。JCVI-syn1.0では、ドナーとレシピエントとして使用される2つの種は同じ属であるため、宿主細胞質中のタンパク質と新しいゲノムとの間のミスマッチの可能性が軽減される。[ a 18 ]ポール・ケイム（フラッグスタッフにある北アリゾナ大学の分子遺伝学者）は、「遺伝子工学者が生物のゲノムをゼロから組み合わせ、完全に設計できるようになるまでには、大きな課題が待ち受けている」と指摘している。[ b 4 ]

透かし

1976年の半導体チップに隠された透かしは、作成者の署名として機能しています。JC・ベンターと彼のチームは、同様に終止コドンを用いた透かしを追加することで、自らの作品に署名を加えました。

JCVI-syn1.0の広く知られている特徴の一つは、透かし配列の存在である。4つの透かし（論文補足資料の図S1 [ a 1 ]に示されている）は、DNAに書き込まれたコード化メッセージであり、それぞれ長さは1246、1081、1109、1222塩基対である。これらのメッセージは、3塩基のDNA配列でアミノ酸をコードする標準的な遺伝暗号ではなく、この目的のために考案された新しい暗号を用いており、読者はこれを解読することが求められた。[ b 8 ]透かしの内容は以下の通りである。

  1. 透かし 1: Web ブラウザで読み取られる、デコーダーを祝福するテキストと、デコードを証明するため作成者に電子メールを送信する方法に関する指示を含むHTMLドキュメント。
  2. ウォーターマーク 2: 著者のリストと、ジェイムズ ジョイスの言葉「生きること、過ちを犯すこと、転ぶこと、勝利すること、そして人生から人生を作り直すこと」。
  3. ウォーターマーク 3: さらに多くの著者とロバート・オッペンハイマーの言葉(クレジットなし): 「物事をあるがままに見るのではなく、あるかもしれないように見なさい」。
  4. ウォーターマーク 4: さらに多くの著者とリチャード ファインマンの言葉: 「構築できないものは理解できない」。

その後の進化

JCVI-syn3.0

合成生物Syn-3.0の最小ゲノムにおける遺伝子機能。[ a 19 ]

2016年、ベンター研究所はJCVI-syn1.0の遺伝子を使って、531,560塩基対と473個の遺伝子を含むJCVI-syn3.0と呼ばれるより小さなゲノムを合成した。[ b 9 ]この新しい生物では、遺伝子の数は473個までしか削減できず、そのうち149個の遺伝子の機能は全く不明である（2016年現在）。[ b 6 ] JCVI-syn3.0を作るために、科学者たちはJCVI-syn2.0と呼ばれる株を使って、どの遺伝子を安全に削除できるかを研究した。[ a 19 ]

JCVI-syn3A

JCVI-syn3.0細胞は壊れやすく、操作が困難でした。また、形状が不規則で変化に富んでいました。この問題に対処するため、2017年にJCVI-syn1.0から19個の遺伝子を追加し、他の2個の遺伝子を削除したJCVI-syn3Aと呼ばれる新株が構築されました。追加された遺伝子には、細胞分割タンパク質FtsZとSepF、および機能不明のタンパク質が含まれています。結果として得られた細菌は、543 kbpのゲノム上に493個の遺伝子（452個のタンパク質、38個のRNA）を有していました。syn3Aのすべての代謝経路の完全な計算モデルは2019年に発表され、生きた最小生物の最初のコンピュータモデルとなりました。このモデルは、338個の化学反応を実行する155個の遺伝子をカバーしていました。将来のモデルでは、リボソーム生合成とtRNA生合成がカバーされる予定です。[ a 20 ]

2019年現在、syn3Aの91個の遺伝子の機能は不明である。これらのうち8個はKEGGに相同遺伝子が存在し、その機能の可能性が部分的に明らかになっている。[ a 20 ]

JCVI-syn3B

JCVI-syn3Bは、この株の進化に関する2021年（2023年発表）の記事で初めて説明されました。[ 1 ]そのゲノムは、M. mycoidesと哺乳類細胞の相互作用のモデルシステムとしての使用を詳述した記事の一部として2024年に発表されました。Syn3Bはこれらの細胞に付着したり、細胞内寄生虫として細胞内で生存したりすることはできませんでしたが、Syn1.0は可能でした。これらの行動にはSyn1.0の8つの遺伝子が必要であることがわかりました。形質転換された株をSyn3Bに再び導入すると、付着することはできましたが、貪食作用を生き延びることはできませんでした。Syn3Bのゲノム（CP146056）は、いくつかのインデルと、Syn3.0にも存在する酵母起源の1186bpのストレッチが追加されていることを除けば、syn3Aのゲノムと非常に類似しています。[ 2 ]

機能が未知の遺伝子に注釈を付ける取り組み

JCVI株における機能未知遺伝子のアノテーションについては、Bianchi et al. (2022) の序論を参照することをお勧めします。これらの遺伝子の解明には、ウェットラボ法とバイオインフォマティクス法の両方が用いられてきました。Bianchi et al. の研究自体が、バイオインフォマティクスを用いて相同タンパク質を発見する試みです。[ a 21 ]

懸念と論争

受付

2007年10月6日、クレイグ・ベンターは英国ガーディアン紙のインタビューで、同チームがマイコプラズマ・ジェニタリウムの単一染色体の改変版を化学的に合成したと発表した。合成されたゲノムはまだ機能する細胞に移植されていなかった。翌日、カナダの生命倫理団体ETCグループは、代表者のパット・ムーニーを通じて声明を発表し、ベンターの「創造物」は「ほぼあらゆるものを構築できる基盤だ。新薬のような人類への貢献にも、生物兵器のような人類への大きな脅威にもなり得る」と述べた。ベンターは「私たちは壮大なアイデアを扱っています。生命のための新しい価値観を創造しようとしているのです。これほどの規模で取り組むとなると、誰もが満足するとは期待できません」と述べた。[ b 10 ]

2010年5月21日、サイエンス誌は、ベンターらの研究グループがコンピューター記録からマイコプラズマ・ミコイデス菌のゲノムを合成し、DNAを除去したマイコプラズマ・カプリコルム菌の既存細胞に移植することに成功したと報じた。この「合成」菌は生存可能、つまり複製が可能であった。[ b 1 ]ベンターはこれを「コンピューターを親に持つ最初の種」と表現した。[ b 11 ]

2016年3月25日、サイエンス誌上で、新たな合成細菌JCVI-3.0の創製が発表されました。この細菌はわずか473個の遺伝子しか持ちません。ベンター氏はこれを「史上初のデザイナー生物」と呼び、必要な遺伝子のうち149個の機能が未解明であるという事実は、「生物学分野全体が生命にとって不可欠なものの3分の1を見逃してきた」ことを意味すると主張しました。[ a 22 ]

報道

このプロジェクトは、ヴェンターのショーマンシップによりマスコミから大きく取り上げられ、合成生物学のパイオニアでありアミリスの創設者でもあるジェイ・キースリングが「我々に必要な唯一の規制は、私の同僚の口から出るものだ」とコメントするほどだった。[ b 12 ]

ユーティリティ

ベンターは、合成細菌は水素やバイオ燃料を製造し、二酸化炭素やその他の温室効果ガスを吸収する生物の創造に向けた一歩であると主張している。一方、合成生物学のもう一人の先駆者であるジョージ・M・チャーチは、大腸菌はM. genitaliumよりも多くのDNAを有していても効率的に増殖するため、完全合成ゲノムの作成は必要ではないという対照的な見解を示している。チャーチは、合成遺伝子が大腸菌に組み込まれ、上記のタスクの一部を実行させていると述べている。[ b 13 ]

知的財産

J・クレイグ・ベンター研究所は、2006年に米国および国際的にマイコプラズマ・ラボラトリアムのゲノム（「最小細菌ゲノム」）の特許を申請した。 [ b 14 ] [ b 15 ] [ a 23 ]カナダの生命倫理団体ETCグループは、特許の範囲が広すぎるとして抗議した。[ b 16 ]

類似プロジェクト

2002年から2010年にかけて、ハンガリー科学アカデミーの研究チームがMDS42と呼ばれる大腸菌株を作成し、現在はウィスコンシン州マディソンのScarab Genomics社が「Clean Genome. E.coli」という名前で販売している。[ b17 ]この株では、分子生物学の効率化を図るため、親株（大腸菌K-12 MG1655）のゲノムの15%が除去され、IS要素、擬似遺伝子、ファージが除去された。その結果、トランスポゾンによって不活性化されることが多いプラスミドにコード化された毒性遺伝子の維持が改善された。[ a24 ] [ a25 ] [ a26 ]生化学および複製機構には変更が加えられていない。

参考文献

一次資料

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ゲノム配列

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