ファイ値分析

ファイ値解析、解析、または-値解析は、タンパク質の折り畳みと立体構造変化における遷移状態と中間体の構造を研究するための実験的タンパク質工学技術である。 [ 1 ] 折り畳み遷移状態の構造は速度論的測定から見つける必要があり、タンパク質 NMRやX 線結晶構造解析などの平衡法ではアクセスできず、中間体は多くの場合可動性があり、定義により部分的に構造化されていない。-値解析では、野生型タンパク質の折り畳み速度論と立体構造折り畳みの安定性を点変異体のものと比較し、ファイ値を求める。これらは、折り畳み遷移状態への変異残基のエネルギー的寄与を測定するものであり、野生型および変異タンパク質の折り畳まれていない状態、折り畳まれた状態、および遷移状態の相対的自由エネルギーを考慮することにより、遷移状態における変異残基の周囲の天然構造の程度を明らかにする。 φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }

タンパク質の残基を一つずつ変異させることで、折り畳まれた遷移状態で整列した残基クラスターを同定する。これらの残基の相互作用は、単一部位変異体の効果を二重変異体の効果と比較する二重変異サイクルφ{\displaystyle \varphi }解析によって確認できる。ほとんどの変異は保存的であり、元の残基をアラニンなどのより小さな残基（空洞形成変異）に置き換えるが、チロシンからフェニルアラニン、イソロイシンからバリン、スレオニンからセリンへの変異体も使用できる。キモトリプシンインヒビター、SH3ドメイン、WWドメイン、タンパク質LおよびGの個々のドメイン、ユビキチン、およびバルナーゼはすべて解析によって研究されている。 φ{\displaystyle \varphi }

数学的アプローチ

(左) または(右)のエネルギー図。Dは変性状態のエネルギー、dagger は遷移状態のエネルギー、N は天然状態のエネルギーです。φ＝0{\textstyle \varphi =0}1{\textstyle 1}

ファイは次のように定義される: [ 2 ]

φ＝（ΔGWTS→D−ΔGMTS→D）（ΔGW北→D−ΔGM北→D）＝ΔΔGTS→DΔΔG北→D{\displaystyle \varphi ={\frac {(\Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{TS\rightarrow D})}{(\Delta G_{W}^{N\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{N\rightarrow D})}}={\frac {\Delta \Delta G^{TS\rightarrow D}}{\デルタ \デルタ G^{N\rightarrow D}}}}

ΔGWTS→D{\displaystyle \Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}}は野生型タンパク質の遷移状態と変性状態との間のエネルギー差、は変異タンパク質における同じエネルギー差、そしてビットは天然状態と変性状態との間のエネルギー差です。ファイ値は、変異がフォールディング状態と比較して遷移状態をどれだけ不安定化させるかとして解釈されます。 ΔGMTS→D{\displaystyle \Delta G_{M}^{TS\rightarrow D}}ΔG北→D{\displaystyle \Delta G^{N\rightarrow D}}

0から1の範囲になることを意図していたかもしれませんが、負の値が現れることもあります。 [ 3 ] 0の値は、変異がフォールディング経路の律速遷移状態の構造に影響を与えないことを示し、1の値は、変異がフォールディングされた状態と同じくらい遷移状態を不安定化させることを示します。0に近い値は、変異の周囲の領域が遷移状態では比較的折り畳まれていない、または構造化されていないことを示し、1に近い値は、変異部位に近い遷移状態の局所構造が天然の状態と似ていることを示唆しています。タンパク質表面の保存的置換は、多くの場合、ファイ値が1に近い値になります。が0と1の間にある場合、どちらが当てはまるかがわからないため、あまり有益ではありません。 φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }

  1. 遷移状態自体が部分的に構造化されている、または
  2. ほぼ同数の2 つのタンパク質集団があり、1 つは大部分が折り畳まれていない種類で、もう 1 つは大部分が折り畳まれています。

主な前提

  1. ファイ値解析は、エネルギーと化学構造は相関関係にあるとするハモンドの公理を前提としています。エネルギーランドスケープが明確に定義された深い大域的極小値を持つ場合、フォールディング中間体と天然状態の構造の関係は、それらのエネルギー間の相関関係を示す可能性がありますが、エネルギーランドスケープがより平坦であったり、多くの局所的極小値を持つ場合、自由エネルギーの不安定化は有用な構造情報を与えない可能性があります。
  2. ファイ値解析では、フォールディング経路は大きく変化していないと仮定しますが、フォールディングエネルギーは変化する可能性があります。非保存的変異ではこの仮定が成り立たない可能性があるため、保存的置換が好まれます。ただし、保存的置換はエネルギー的な不安定化が小さく、検出が困難になる可能性があります。
  3. 0より大きい数値に制限することは、変異が安定性を高め、天然状態と遷移状態のどちらのエネルギーも低下させないと仮定することと同じです。フォールディング遷移状態を安定化する相互作用は天然構造のものと似ていると仮定するのも同じ考え方ですが、タンパク質フォールディングに関する研究では、遷移状態における非天然相互作用の安定化がフォールディングを促進することが示されています。[ 4 ]φ{\displaystyle \varphi }

例: barnase

アラン・ファーシュトは、細菌の小さなタンパク質バーナーゼの研究でファイ値解析の先駆者となった。[ 5 ] [ 6 ]分子動力学シミュレーションを使用して、彼は折り畳みと展開の間の遷移状態が天然の状態に似ており、反応方向に関係なく同じであることを発見した。ファイは変異の位置によって変化し、ある領域はゼロに近い値を示し、他の領域は 1 に近い値を示した。タンパク質配列全体の値の分布は、シミュレートされた遷移状態のすべてと一致したが、1 つのヘリックスだけが半独立して折り畳まれ、遷移状態が完全に形成された後にのみ、タンパク質の残りの部分と天然のような接触をした。1 つのタンパク質における折り畳み速度のこのような変化は、値を解釈することを困難にする。そうでなければ、遷移状態構造を計算コストが高い折り畳み-展開シミュレーションと比較しなければならないからである。 φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }

変種

折り畳み遷移状態を研究するための他の「運動学的摂動」技術が最近登場した。最もよく知られているのは psi ( ) 値[ 7 ] [ 8 ]である。これは、ヒスチジンなどの金属結合アミノ酸残基を2つタンパク質に導入し、金属イオン濃度の関数として折り畳み速度を記録することによって求められるが[ 9 ] 、 Fersht はこのアプローチは難しいと考えていた。[ 10 ] -値の「架橋」変種は、ジスルフィド結合などの共有結合架橋が導入された折り畳み遷移状態におけるセグメントの関連性を研究するために使用された。 [ 11 ] -T値分析は、 -値分析の拡張として使用され、温度の関数として変異体の応答を測定し、遷移状態の自由エネルギーへのエンタルピーとエントロピーの寄与を分離するために使用されている。[ 12 ]ψ{\displaystyle \psi}φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }

制限事項

平衡安定性と水性（アン）フォールディング速度の測定における誤差は、変性剤を含む溶液の値をほぼ純粋な水溶液に外挿しなければならない場合や、天然タンパク質と変異タンパク質の安定性の差が「低い」、つまり 7 kJ/mol 未満の場合には大きくなる可能性がある。このため、が 0～1 の範囲を超える可能性がある。[ 13 ]計算値は、利用可能なデータポイントの数に大きく依存する。[ 14 ]慎重な実験設計により誤差は最小限に抑えられる。[ 15 ]残基あたり最大 4 つの変異を持つ WW ドメインの 78 個の変異体の研究では、どのような種類の変異が天然状態の柔軟性、溶媒和、その他の影響による干渉を回避するかを定量化し、統計解析により、大規模な変異体スクリーニングから遷移状態の摂動に関する信頼性の高い情報が得られることが示されている。[ 16 ]φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }φ{\displaystyle \varphi }

参照

参考文献

  1. ^ Fersht, AR (2024). 「化学における共有結合遷移状態から生物学における非共有結合遷移状態へ：タンパク質フォールディングのβ値解析からΦ値解析へ」 . Quarterly Reviews of Biophysics . 57 e4 e4. doi : 10.1017/S0033583523000045 . PMID  38597675 .
  2. ^ Daggett V , Fersht AR. (2000). タンパク質フォールディングにおける遷移状態. 『タンパク質フォールディングのメカニズム』第2版, RH Pain編. オックスフォード大学出版局.
  3. ^ Rios, MA; Daneshi, M; Plaxco, KW (2005). 「二状態タンパク質における負のファイ値の頻度と置換依存性に関する実験的研究」.生化学. 44 (36): 12160–7 . doi : 10.1021/bi0505621 . PMID 16142914 . 
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  9. ^ Krantz, BA; Sosnick, TR (2001). 「人工金属結合部位がコイルドコイルの不均一な折り畳み構造を明らかにする」Nat . Struct. Biol . 8 (12): 1042– 1047. doi : 10.1038/nsb723 . PMID 11694889. S2CID 940674 .  
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  16. ^ Dave, K; Jäger, M; Nguyen, H; Kelly, JW; Gruebele, M (2016). 「WWドメインのフォールディング遷移状態の高解像度マッピング」. Journal of Molecular Biology . 428 (8): 115– 128. doi : 10.1016/j.jmb.2016.02.008 . PMC 4835268. PMID 26880334 .  
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