プラスミド調製
DNA抽出および精製の生物学的方法
プラスミドミニプレップ。0.8%アガロースゲル、 エチジウムブロマイド染色。

プラスミド調製は、プラスミドDNAの抽出および精製法です。多くの分子生物学実験において重要なステップであり、研究やバイオテクノロジーにおけるプラスミドの有効利用に不可欠です。[1] [2]細菌からプラスミドDNAを精製するための多くの方法が開発されています。[1] [3]精製手順において、プラスミドDNAはしばしば混入タンパク質やゲノムDNAから分離されます。

これらの方法は、細菌培養の増殖、細菌の回収と溶解、そしてプラスミドDNAの精製という3つのステップを必ず伴います。 [4]プラスミドの精製は分子クローニングの中心です。精製されたプラスミドは、シークエンシングや細胞への トランスフェクションなど、多くの標準的な用途に使用できます。

細菌培養の増殖

プラスミドは、ほとんどの場合、通常は大腸菌などの液体細菌培養物から精製され、これを形質転換して分離します。[5] [6]一般に使用されている実質的にすべてのプラスミドベクターは、選択マーカーとして、例えばアンピシリンやカナマイシン耐性をコードする遺伝子など、1つ以上の抗生物質耐性遺伝子をコードしており、これにより、形質転換に成功した細菌は阻害されずに増殖することができます。 [7] [8] [9]プラスミドベクターを取り込まなかった細菌は耐性遺伝子を欠いていると考えられ、したがって、形質転換に成功したコロニーのみが増殖すると予想されます。[5] [9] [10] 細菌は好ましい条件下で増殖します。

細菌の採取と溶解

細胞溶解には、アルカリ溶解、機械的溶解、酵素溶解などいくつかの方法があります。[11] [12] [13] [14]

アルカリ溶解

最も一般的な方法はアルカリ溶解であり、これは水酸化ナトリウムなどの高濃度の塩基性溶液を使用して細菌細胞を溶解するものである。[15] [16] [17]細菌をアルカリ条件（pH 12.0～12.5）で溶解すると、染色体 DNA とタンパク質の両方が変性する。しかし、プラスミド DNA は安定したままである。[16] [17] ssDNAの発生を減らすために、使用する NaOH の濃度を 0.1 M まで下げる科学者もいる。酢酸を含む中和緩衝液を加えて pH を約 7 まで下げると、大きくて超らせん構造の少ない 染色体DNA とタンパク質が大きな複合体を形成して沈殿するが、小さな細菌 DNA プラスミドは溶液中に残る。[17] [14]

機械的溶解

機械的溶解は、粉砕や超音波処理などの物理的な力を用いて細菌細胞を分解し、プラスミドDNAを遊離させる方法です。フレンチプレス、ビーズビーティング、超音波処理など、様々な機械的溶解法が用いられます。[11] [12] [13] [14]

酵素分解

酵素溶解（リゾチーム溶解とも呼ばれる）は、酵素を用いて細胞壁を分解し、プラスミドDNAを遊離させる方法です。[11]この目的で最も一般的に使用される酵素はリゾチームで、グラム陽性細菌の細胞壁に含まれるペプチドグリカンを分解します。リゾチームは通常、細菌培養物に添加され、その後、培養物を加熱および／または振盪することでプラスミドDNAを遊離させます。[11] [12] [13] [14]

サイズ別製剤

プラスミド調製は、調製規模に基づいて、ミニ調製、ミディ調製、マキシ調製、メガ調製、ギガ調製の5つの主要なカテゴリーに分類されます。どの方法を使用するかは、必要なプラスミドDNAの量と、その用途に応じて異なります。[18] [19]

プラスミドDNAを精製するためのキットは、様々なメーカーから販売されており、細菌培養液の量とそれに対応するプラスミド収量によって名称が付けられています。キットの名称は、少ない順に、ミニプレップ、ミディプレップ、マキシプレップ、メガプレップ、ギガプレップです。プラスミドDNAの収量は、プラスミドのコピー数、種類、サイズ、細菌株、培養条件、そしてキットによって異なります。[2]

ミニプレパレーション

プラスミドDNAのミニプレパレーションは、細菌からプラスミド DNAを迅速かつ小規模に分離する方法である。[20] [21]一般的に用いられるミニプレップ法には、アルカリ溶解法とスピンカラムベースのキットがある。[3] [22]これはアルカリ溶解法に基づいている。ミニプレップによって抽出されたプラスミドDNAは、それ自体がしばしば「ミニプレップ」と呼ばれる。ミニプレップは、分子クローニングのプロセスにおいて細菌クローンを解析するために使用される。ミニプレップから得られる典型的なプラスミドDNA収量は、細胞株に応じて5～50μgである。多数のプラスミドのミニプレップは、細胞を溶解し、プラスミドをろ紙上に溶出させることで、ろ紙上で簡便に行うこともできる。[21]

中期準備

大腸菌の初期培養量は 15 ～ 25 mL の溶原性培地(LB) で、予想される DNA 収量は 100 ～ 350 μg です。

マキシプレパレーション

開始時の大腸菌培養量は LB 100～200 mL で、予想される DNA 収量は 500～850 μg です。

大規模な準備

大腸菌の初期培養容量は 500 mL ～ 2.5 L の LB で、予想される DNA 収量は 1.5 ～ 2.5 mg です。

ギガプレパレーション

大腸菌培養の開始容量は LB 2.5～5 L で、予想される DNA 収量は 7.5～10 mg です。

プラスミドDNAの精製

精製方法を選択する際には、プラスミドDNAの下流用途を考慮することが重要です。例えば、プラスミドをトランスフェクションやエレクトロポレーションに使用する場合は、高純度でエンドトキシンレベルが低い精製方法が望ましいです。同様に、プラスミドをシークエンシングやPCRに使用する場合は、高収量で汚染物質を最小限に抑えた精製方法が望ましいです。[2] しかし、核酸の精製方法は複数存在します。[23] [24] [25]いずれも、核酸のみが沈殿するか、他の生体分子のみが沈殿する条件を作り出し、核酸を分離するという原理に基づいています。[15] [23]

エタノール沈殿

エタノール沈殿法は、プラスミドDNAを含む核酸の精製・濃縮に広く用いられている方法である。[26]この方法の基本原理は、核酸はエタノールやイソプロパノールには不溶だが、水には可溶であるという点にある。したがって、エタノールをDNAの抗溶媒として利用することで、DNAを溶液から沈殿させ、遠心分離によって回収することができる。可溶性画分は他の生体分子を除去するために廃棄される。[27]

スピンカラム

スピンカラムを用いた核酸精製は 、スピンカラムフィルターを用いてサンプルからDNA、RNA、またはプラスミドを精製する方法である。[25]この方法は、スピンカラム内の固体マトリックスに核酸を選択的に結合させ、タンパク質や塩などの他の夾雑物を洗い流すという原理に基づいている。その後、適切な溶出バッファーを用いて精製された核酸をカラムから溶出させる。[25]

フェノール・クロロホルム抽出

フェノール-クロロホルム抽出の基本原理は、DNAとRNAはフェノールとクロロホルムに比較的溶けにくいのに対し、他の細胞成分はこれらの溶媒に比較的溶けやすいという点です。フェノール/クロロホルム混合液を添加すると、タンパク質や脂質などの夾雑物が溶解し、核酸が水相に残ります。また、DNaseなどのタンパク質も変性します。これは、プラスミドを酵素分解に用いる場合に特に重要です。そうでなければ、酵素分解されたプラスミドDNAはスメアリングを起こす可能性があります。[24]

ビーズベースの抽出

ビーズベースの抽出では、一般的に鉄イオンで作られた磁性ビーズを含む混合物を加えることでプラスミドDNAに結合し、磁性棒または磁気スタンドによって不要な化合物から分離します。[25]プラスミドに結合したビーズは磁場を除去することで放出され、形質転換や制限酵素消化などの下流実験のために溶出液に抽出されます。この形式のミニプレップは自動化も可能であり、利便性が向上するとともに機械的誤差も低減します。

参考文献

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さらに読む

  • Birnboim HC, Doly J (1979年11月). 「組換えプラスミドDNAのスクリーニングのための迅速アルカリ抽出法」. Nucleic Acids Research . 7 (6): 1513– 1523. doi :10.1093/nar/7.6.1513. PMC  342324. PMID  388356 .
  • http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Plasmid/Miniprep/
  • 精製および洗浄中に DNA を結合するために珪藻土を使用するミニプレップ手順。
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