ポロニーシーケンスは、安価でありながら高精度なマルチプレックスシーケンス技術であり、何百万もの固定化された DNA 配列を並行して「読み取る」ために使用できます。この技術は、ハーバード大学医学部のGeorge Church 博士のグループによって初めて開発されました。他のシーケンス技術とは異なり、ポロニーシーケンス技術は、無料でダウンロードできるオープンソースのソフトウェアとプロトコルを備えたオープンプラットフォームです。また、この技術のハードウェアは、一般に入手可能な落射蛍光顕微鏡とコンピューター制御のフローセル/流体システムを使用して簡単にセットアップできます。ポロニーシーケンスは、通常、 DNA テンプレートの各分子が 135 bp の長さで、2 つの 17～18 bp のペアのゲノムタグが共通配列で区切られ、両側に配置されているペアエンドタグライブラリで実行されます。この技術の現在の読み取り長は、アンプリコンあたり 26 塩基、タグあたり 13 塩基であり、各タグには 4～5 塩基のギャップが残ります。
ワークフロー
ポロニー配列決定のプロトコルは、ペアエンドタグライブラリの構築、テンプレートの増幅、およびDNA 配列決定の 3 つの主要な部分に分けられます。
ペアエンドタグライブラリ構築
このプロトコルは、まず、検査対象のゲノム DNA をランダムに剪断し、厳密なサイズ分布を形成することから始まります。剪断された DNA 分子は、末端修復および A テール化処理にかけられます。末端修復処理では、DNA の損傷または不適合な突出末端を 5' リン酸化され平滑末端化された DNA に変換し、直ちに平滑末端ライゲーションを可能にします。一方、A テール化処理では、剪断された DNA の 3' 末端に A を付加します。長さ 1 kb の DNA 分子を 6% TBE PAGE ゲルにロードして選択します。次のステップでは、DNA 分子は、2 つの外向きの MmeI 認識部位を含む T テール化された 30 bp 長の合成オリゴヌクレオチド (T30) で環状化され、結果として得られた環状 DNA はローリングサークル複製を受けます。次に、増幅された環状 DNA 分子は MmeI (タイプ IIs 制限エンドヌクレアーゼ) で消化され、認識部位から離れた場所で切断され、17～18 bp のタグ (長さ約 70 bp) に挟まれた T30 フラグメントが放出されます。ペアタグ分子は、ePCR (エマルジョン PCR) プライマーオリゴヌクレオチド (FDV2 および RDV2) を両端にライゲーションする前に、末端修復する必要があります。結果として得られる 135 bp のライブラリ分子は、サイズ選択され、ニックトランスレーションされます。最後に、135 bp のペアエンドタグライブラリ分子をPCRで増幅して、ライブラリ材料の量を増やし、余分なライゲーション産物を 1 ステップで除去します。結果として得られる DNA テンプレートは、44 bp の FDV 配列、17～18 bp の近位タグ、T30 配列、17～18 bp の遠位タグ、および 25 bp の RDV 配列で構成されます。
テンプレート増幅
エマルジョンPCR
単一サイズの常磁性ストレプトアビジンコーティングビーズには、ビオチンを含むフォワードプライマーがあらかじめロードされています。ストレプトアビジンはビオチンに対して非常に強い親和性を持つため、フォワードプライマーはビーズ表面にしっかりと結合します。次に、ロード済みのビーズ、PCR反応液、フォワードプライマーとリバースプライマー、そしてペアになったエンドタグライブラリを含む水相を調製します。これを油相と混合し、ボルテックスで撹拌してエマルジョンを作成します。理想的には、油相中の水滴1滴あたりにビーズ1個と鋳型DNA分子1分子が含まれるため、PCRを行うことで、1ミリリットル規模の体積内で相互作用のない数百万回の増幅が可能になります。
エマルジョン破壊
増幅後、前ステップで得られたエマルジョンをイソプロパノールおよび界面活性剤緩衝液（10 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA pH 8.0、100 mM NaCl、1% (v/v) Triton X-100、1% (w/v) SDS）を用いて破壊し、ボルテックス、遠心分離、磁気分離を順に行う。得られた溶液は、空ビーズ、クローンビーズ、非クローンビーズの懸濁液であり、これらはそれぞれ、最初はDNA鋳型分子を0個、1個、または複数個含むエマルジョン液滴から生じる。増幅されたビーズは、次のステップで濃縮することができる。
ビーズエンリッチメント
増幅ビーズの濃縮は、ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチド（ePCRアンプリコン配列に相補的なDNA配列）を予め導入した、大型で低密度の非磁性ポリスチレンビーズとのハイブリダイゼーションによって行われます。その後、混合物を遠心分離し、増幅ビーズとキャプチャービーズの複合体を増幅前のビーズから分離します。増幅ビーズとキャプチャービーズの複合体は密度が低いため、上清に残りますが、増幅前のビーズはペレットを形成します。上清を回収し、NaOHで処理して複合体を分解します。常磁性増幅ビーズは、磁気分離によって非磁性キャプチャービーズから分離されます。この濃縮プロトコルは、増幅ビーズを5倍に濃縮することが可能です。
ビーズキャッピング
ビーズキャッピングの目的は、伸長していないフォワードePCRプライマーの3'末端とテンプレートDNAのRDVセグメントの両方に「キャッピング」オリゴヌクレオチドを付加することです。ここで用いられるキャップはアミノ基であり、蛍光プローブがこれらの末端にライゲーションするのを防ぎ、同時に、その後のテンプレートDNAとアミノシラン化フローセルカバーガラスとのカップリングを促進します。
カバーガラスの配列
まず、カバーガラスを洗浄し、アミノシラン処理します。これにより、テンプレートDNAが共有結合し、蛍光汚染が除去されます。増幅された濃縮ビーズをアクリルアミドと混合し、テフロンマスクを施した顕微鏡スライドで作った浅い型に流し込みます。すぐに、アミノシラン処理したカバーガラスをアクリルアミドゲルの上に置き、45分間重合させます。次に、スライドとカバーガラスを反転させ、ゲルから顕微鏡スライドを取り外します。シラン処理したカバーガラスはゲルに共有結合し、顕微鏡スライド表面のテフロン加工により、アクリルアミドゲルからスライドがより容易に剥がれます。カバーガラスはフローセル本体に接着され、未結合のビーズは除去されます。
DNA配列解析
ポロニーシーケンシングの生化学は、主にリガーゼとポリメラーゼの識別能力に依存しています。まず、一連のアンカープライマーを細胞に流し込み、17～18bpの近位または遠位ゲノムDNAタグの3'末端または5'末端にある合成オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズします。次に、アンカープライマーと蛍光色素で標識された縮重 ノナマーの集団との酵素ライゲーション反応が行われます。
識別標識ノナマー：
5' Cy5‐NNNNNNNNT
5' Cy3‐NNNNNNNNA
5' TexasRed‐NNNNNNNNC
5' 6FAM‐NNNNNNNG
蛍光標識ノナマーは、縮重プライマーと同様の戦略に従って、タグ配列に異なる成功率でアニールしますが、ポリメラーゼに供される代わりに、ノナマーは隣接するDNA、すなわちアンカープライマーに選択的にライゲーションされます。蛍光標識分子の固定により、ゲノムDNAタグのクエリー位置にA、C、G、またはTが存在するかどうかを示す蛍光シグナルが生成されます。4色イメージング後、アンカープライマー/ノナマー複合体は剥離され、アンカープライマーを交換することで新しいサイクルが開始されます。蛍光標識ノナマーの新しい混合物が導入され、クエリー位置はゲノムDNAタグのさらに1塩基分シフトします。
5' Cy5‐NNNNNNNNTN
5' Cy3‐NNNNNNNAN
5' TexasRed‐NNNNNNNCN
5' 6FAM‐NNNNNNGN
この方法では、5'から3'方向の7塩基と3'末端からの6塩基を検索できます。最終的な結果は、1回のランあたり26塩基（ペアタグそれぞれから13塩基）のリード長となり、各タグの中央に4塩基から5塩基のギャップが存在します。
分析とソフトウェア
ポロニーシーケンシングでは、1回のランで数百万個の26リードが生成されるため、この情報を正規化して配列に変換する必要がありました。これは、チャーチ研究所が開発したソフトウェアによって実行できます。このソフトウェアはすべて無料で、ウェブサイトからダウンロードできます。[1]
楽器
この技術で使用されるシーケンシング装置は、一般的な蛍光顕微鏡とコンピュータ制御のフローセルでセットアップできます。必要な装置の価格は、2005年時点で約13万ドルでした。[要出典]専用のポロニーシーケンシング装置であるPolonatorは2009年に開発され、 Doverによって17万ドルで販売されました。[2] [3]この装置はオープンソースのソフトウェア、試薬、プロトコルを備えており、パーソナルゲノムプロジェクトでの使用を目的としていました。[4]
強みと弱み
ポロニーシーケンシングは、一般的に入手可能で安価な機器を用いて、ハイスループットかつ高いコンセンサス精度のDNAシーケンシングを可能にします。また、非常に柔軟性の高い技術であり、BAC（細菌人工染色体）や細菌ゲノムリシーケンシング、SAGE（遺伝子発現の連続解析）タグおよびバーコードシーケンシングなど、多様なアプリケーションに対応可能です。さらに、ポロニーシーケンシング技術は、開発されたソフトウェア、プロトコル、試薬など、あらゆるものを共有するオープンシステムとして重視されています。
しかしながら、生データの取得は最大786ギガビットまで達成できるものの、収集された10,000ビットの情報のうち有用なのはわずか1ビットです。この技術のもう一つの課題は、個々のターゲットにおける相対的な増幅の均一性です。増幅の不均一性はシーケンシングの効率を低下させる可能性があり、この技術における最大の障害となっています。
歴史
ポロニーシーケンシングは、 1990年代後半から2000年代にかけてのポロニー技術の発展である。 [5] 2003年には、 5～6塩基の読み取りが可能なシングルベースエクステンションを使用して、in situポロニーをシーケンシングする方法が開発された。 [6] 2005年までに、これらの初期の試みは見直され、既存のポロニーシーケンシング技術が開発された。[7]ポロニーシーケンシングの高度に並列化されたライゲーションによるシーケンシングのコンセプトは、ABIソリッドシーケンシングなどの後のシーケンシング技術の基礎に貢献した。
参考文献
- ^ 「オープンソースシーケンシング」. arep.med.harvard.edu . 2017年9月17日閲覧。
- ^ 「早期アクセスフェーズを経て、アップデートされたPolonatorが17万ドルの価格でロールアウト準備完了」GenomeWeb 2009年5月5日. 2017年9月17日閲覧。
- ^ 「ドーバーのポロネーターはダナハーのリストラの影響を受けない、と当局者が語る」GenomeWeb 2009年9月8日. 2017年9月17日閲覧。
- ^ “The Polonator”. 2015年4月3日. 2015年4月3日時点のオリジナルよりアーカイブ。2017年9月17日閲覧。
- ^ Adessi, C.; Matton, G.; Ayala, G.; Turcatti, G.; Mermod, JJ; Mayer, P.; Kawashima, E. (2000-10-15). 「固相DNA増幅：プライマー付着と増幅機構の特徴づけ」. Nucleic Acids Research . 28 (20): E87. doi :10.1093/nar/28.20.e87. ISSN 1362-4962. PMC 110803. PMID 11024189 .
- ^ Shendure, Jay; Porreca, Gregory J.; Reppas, Nikos B.; Lin, Xiaoxia; McCutcheon, John P.; Rosenbaum, Abraham M.; Wang, Michael D.; Zhang, Kun; Mitra, Robi D. (2005-09-09). 「進化した細菌ゲノムの正確なマルチプレックス・ポロニーシーケンシング」. Science . 309 (5741): 1728– 1732. Bibcode :2005Sci...309.1728S. doi : 10.1126/science.1117389. ISSN 0036-8075 . PMID 16081699. S2CID 11405973.
- ^ Shendure, Jay; Porreca, Gregory J.; Reppas, Nikos B.; Lin, Xiaoxia; McCutcheon, John P.; Rosenbaum, Abraham M.; Wang, Michael D.; Zhang, Kun; Mitra, Robi D. (2005-09-09). 「進化した細菌ゲノムの正確なマルチプレックス・ポロニーシーケンシング」. Science . 309 (5741): 1728– 1732. Bibcode :2005Sci...309.1728S. doi : 10.1126/science.1117389. ISSN 0036-8075 . PMID 16081699. S2CID 11405973.
外部リンク
- 「超低コストシーケンシング」ハーバード分子技術研究所
- 「ポロネーター」. ドーバー・システムズ. 2013年5月21日時点のオリジナルよりアーカイブ。
