タンパク質膜ボルタンメトリー
Method of chemical analysis

電気化学において、タンパク質膜ボルタンメトリー（タンパク質膜電気化学、あるいはタンパク質の直接電気化学）は、電極上に固定化された（吸着または共有結合された）タンパク質の挙動を調べる技術である。この技術は、電子移動反応に関与するタンパク質や酵素に適用でき、酵素の反応速度論を研究するための手法の一つである。[要出典]

タンパク質が電極表面と適切に接触し（電極とタンパク質間の電子移動が直接的である）、変性していない限り、電極電位やその他の実験パラメータの関数として電流を監視することで、タンパク質を効果的に調査することができます。

様々な電極材料を使用することができる。[1]膜結合タンパク質を扱うには特別な電極設計が必要である。[2]

酸化還元タンパク質の実験

シトクロムやフェレドキシンなどの小さな酸化還元タンパク質は、その電気活性被覆率（直接電子伝達を受けるタンパク質の量）が十分に大きい（実際には、pmol/cm 2の何分の一以上）という条件で調査できます。

小さなタンパク質から得られる電気化学データは、タンパク質の酸化還元部位の酸化還元電位[3] 、タンパク質と電極間の電子移動速度[4]、または電子移動と結合した化学反応（プロトン化など）の速度を測定するために使用できます。[5]

ピーク電流とピーク面積の解釈

図1. 低速走査速度の限界において電極に吸着した1電子（A）または2電子（B）酸化還元種のボルタンメトリー信号。ここでプロットされた電流は で正規化されており、測定された電流は走査速度（ ）に比例して増加することを示しています。 F 2 ν A Γ / R T {\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT} ν {\displaystyle \nu }
図2. 電極に吸着した一電子酸化還元種のボルタンメトリーにおける走査速度の影響（ここで示されている電流は で正規化されており、測定された電流は走査速度（）に比例して増加することを意味する）、Kで計算。走査速度は青から赤に増加する。A：ボルタモグラム。B：ピーク電位 F 2 ν A Γ / R T {\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT} ν {\displaystyle \nu } α = 0.5 {\displaystyle \alpha =0.5} T = 298 {\displaystyle T=298}

吸着酸化還元タンパク質を用いたサイクリックボルタンメトリー実験では、各酸化還元部位の酸化と還元は、正と負のピークのペアとして現れる。電位掃引中に試料全体が酸化または還元されるため、ピーク電流とピーク面積は走査速度に比例するはずである（ピーク電流が走査速度に比例することは、ピークを与える酸化還元種が実際には固定化されていることを証明している）。[3]非生物学的酸化還元分子を電極に吸着させた実験でも同様の結果が現れる。この理論は、主に1980年代にフランスの電気化学者エティエンヌ・ラヴィロンによって発展した[4] 、 [ 6] 、[7] 。

このファラデー電流（吸着分子の酸化還元反応によって生じる）と容量電流（電極の充電によって生じる）はどちらも走査速度に比例して増加するため、走査速度を上げても同様にピークは観測されるはずです。一方、酸化還元被検体が溶液中に存在し、電極との間で拡散する場合、ピーク電流は走査速度の平方根に比例します（ Randles-Sevcikの式を参照）。

ピークエリア

スキャン速度に関わらず、ピーク下面積（単位：AV）は に等しい。ここで、 は中心の酸化還元反応で交換される電子数、は電極表面、は電気活性被覆率（単位：mol/cm 2）である。[3]したがって、後者は容量電流を差し引いたピーク下面積から推定することができる。 n F A Γ ν {\displaystyle nFA\Gamma \nu } n {\displaystyle n} A {\displaystyle A} Γ {\displaystyle \Gamma }

ピーク形状

スキャン速度が遅い

スキャン速度が遅い場合、酸化ピークと還元ピークの間に分離は発生しません。

  • 1電子サイト（例：ヘムまたはFeSクラスター）はブロードなピークを示します（図1A）。ピークの形状と強度を与える式は次のとおりです。
i F 2 ν A Γ / R T = ± exp ⁡ ( F R T ( E − E 0 ) ) ( 1 + exp ⁡ ( F R T ( E − E 0 ) ) 2 {\displaystyle {\frac {i}{F^{2}\nu A\Gamma /RT}}=\pm {\frac {\exp \left({\frac {F}{RT}}(E-E^{0})\right)}{(1+\exp \left({\frac {F}{RT}}(E-E^{0})\right)^{2}}}}
理想的には、ピーク位置は両方向にあります。ピーク電流は（スキャン速度 、および電極上の酸化還元サイトの量 に比例します）。理想的な半値幅（HWHH）は、20 °CにおけるmVに相当します。非理想的な動作では、ピークが理想的な限界よりも広くなる可能性があります。 E p = E 0 {\displaystyle E_{p}=E^{0}} i p = F 2 ν A Γ / 4 R T {\displaystyle i_{p}=F^{2}\nu A\Gamma /4RT} ν {\displaystyle \nu } A Γ {\displaystyle A\Gamma } R T / F × ln ⁡ ( 3 + 2 2 ) = 89 {\displaystyle RT/F\times \ln(3+2{\sqrt {2}})=89}
  • 2電子酸化還元部位（例えばフラビン）のピーク形状は、半還元状態の安定性に依存する（図1B）。半還元状態が広い電極電位範囲にわたって安定している場合、信号は2つの1電子ピークの和となる（図1Bの紫色の線）。半還元状態が不安定な場合、信号は単一のピークとなる（図1Bの赤線の線）。そのピークの高さは1電子ピークの最大4倍、幅は半分になることもある。[6] 、[8]
  • 複数の酸化還元中心を含むタンパク質は、すべて同じ面積（ でスケール）を持つ複数のピークを生成するはずです。 n {\displaystyle n}
高速スキャン速度

反応が単純な電子移動反応であれば、高速スキャンでもピークは対称のままであるはずです。スキャン速度が のとき、ピーク分離が見られます。ここではButler Volmer 理論における交換電子移動速度定数です。Laviron の式[4] 、[8] 、[9] は、高速スキャン速度では、ピークが に比例して分離することを予測しています。 が大きいか小さいほど、ピーク分離は大きくなります。ピーク電位は、[4]で、図 2B の線で示されています (は電荷移動係数)。したがって、スキャン速度に対するピーク位置の実験的変化を調べることで、界面電子移動速度について情報を得ることができます。 ν ≫ R T k 0 / F {\displaystyle \nu \gg RTk^{0}/F} k 0 {\displaystyle k_{0}} log ⁡ ( ν / k 0 ) {\displaystyle \log(\nu /k^{0})} ν {\displaystyle \nu } k 0 {\displaystyle k^{0}} E p = E 0 ± R T α F ln ⁡ α F ν k 0 R T {\displaystyle E_{p}=E^{0}\pm {\frac {RT}{\alpha F}}\ln {\frac {\alpha F\nu }{k^{0}RT}}} α {\displaystyle \alpha } k 0 {\displaystyle k^{0}}

結合化学反応の影響

共役反応とは、研究対象となる種の酸化型と還元型で、反応速度または平衡定数が異なる反応のことです。例えば、還元はプロトン化（）を優先します。プロトン化反応は における還元と共役しています。また、小さな分子（プロトン以外）の結合も酸化還元反応と共役することがあります。 p K a o x < p K a r e d {\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pK_{a}^{\rm {red}}} p K a o x < p H < p K a r e d {\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pH<pK_{a}^{\rm {red}}}

結合反応が遅いか速いか（結合反応の時間スケールがボルタンメトリーの時間スケールより大きいか小さいかを意味する[10] ） に応じて2つのケースを考慮する必要がある。 τ = R T / F ν {\displaystyle \tau =RT/F\nu }

  • 電子移動を伴う高速化学反応（例えばプロトン化）は、およびの見かけの値にのみ影響を与えますが[7]、ピークは対称性を維持します。配位子濃度への依存性（例えば、プールベ図にプロットされたpHへの依存性）は、酸化還元種の酸化型または還元型から解離定数（例えば、酸性度定数）を得るために解釈できます。 E 0 {\displaystyle E^{0}} k 0 {\displaystyle k^{0}} E 0 {\displaystyle E^{0}} E 0 {\displaystyle E^{0}}
  • 非対称性は、電子移動と共役する（そして電子移動を阻害する）遅い化学反応によって生じる可能性がある。高速スキャンボルタンメトリーから、電子移動と共役する反応の速度に関する情報を得ることができる。可逆的な表面電気化学反応の後に不可逆的な化学反応が続くケースについては、Lavironが文献[6] 、[11]で取り上げているが、データは通常、適切な微分方程式の数値解を用いて解釈される。[9] n = 1 {\displaystyle n=1} n = 2 {\displaystyle n=2}

酸化還元酵素の実験

酵素の研究では、電流は酵素の基質の触媒的酸化または還元によって生じます。

大型酸化還元酵素（ラッカーゼ、ヒドロゲナーゼなど）の電気活性被覆率は、基質が存在しない状態では信号を検出するには低すぎることが多いが、電気化学的信号は触媒作用によって増幅される。実際、触媒電流は回転速度と電気活性被覆率の積に比例する。電極電位、pH 、基質および阻害剤の濃度などを変化させた場合の効果を調べることで、触媒機構の様々な段階について理解を深めることができる。[8]

触媒電流値の解釈

電極上に固定化された酵素の場合、ある電位における電流値は と等しくなります。ここで、 は触媒反応で交換される電子数、は電極表面、は電気活性被覆率、TOFはターンオーバー頻度（または「ターンオーバー数」）、つまり1秒あたりおよび吸着酵素1分子あたりに変換される基質分子の数です。後者は、が既知である場合にのみ電流の絶対値から推定できますが、そのようなケースは稀です。しかし、実験条件の変化に伴う電流の相対的な変化を分析することで、情報が得られます。 ± n F A Γ × T O F {\displaystyle \pm nFA\Gamma \times {\rm {TOF}}} n {\displaystyle n} A {\displaystyle A} Γ {\displaystyle \Gamma } A Γ {\displaystyle A\Gamma }

TOF に影響を及ぼす可能性のある要因は、(i) 酵素が固定化されている電極への基質の質量輸送 (拡散と対流)、(ii) 電極と酵素間の電子移動速度(界面電子移動)、および (iii) 酵素の「固有の」活性であり、これらはすべて電極電位に依存する可能性があります。

酵素は、電極近傍での基質の枯渇を防ぐため、高速で回転するディスク型作用電極（RDE）上に固定化されることが多い。この場合、酵素が吸着している電極への基質の質量輸送は、酵素に影響を与えない可能性がある。

定常ボルタンメトリー応答

非常に酸化的または非常に還元的な条件下では、定常触媒電流は限界値（プラトー）に達する傾向があり、これは（物質輸送の制限がない場合に限り）それぞれ完全に酸化された酵素または完全に還元された酵素の活性に関係する。界面電子移動が遅く、電子移動速度に分布がある場合（電極上の酵素分子の配向分布に起因する）、電流はプラトーに達する代わりに電位に比例して増加し続ける。この場合、限界勾配は完全に酸化された酵素または完全に還元された酵素のターンオーバー速度に比例する。[8]

定常電流と電位の変化は複雑であることが多い（例えば、単純なシグモイド曲線ではない）。[12]

定常状態からの逸脱

もう一つの複雑さは、酵素の活性を変化させ、応答を定常状態から逸脱させる可能性のある、遅い酸化還元反応の存在から生じます。 [13]ここで遅いとは、（不）活性化の時間スケールがボルタンメトリーの時間スケールと類似していることを意味します[10] 。RDEを使用する場合、これらの遅い（不）活性化は、質量輸送に起因しない触媒ボルタモグラムのヒステリシスによって検出されます。このヒステリシスは、非常に速いスキャン速度（不活性化が進行する時間がない場合）または非常に遅いスキャン速度（（不）活性化反応が定常​​状態に達した場合）では消失する可能性があります。[14] τ = R T / F ν {\displaystyle \tau =RT/F\nu }

タンパク質膜ボルタンメトリーと分光法の組み合わせ

従来のボルタンメトリーでは、酵素-電極界面および反応に関与する種の構造について限定的な情報しか得られません。標準的な電気化学を他の手法と組み合わせることで、触媒作用のより完全な理解が得られます。[15] [16] [17]

参考文献

  1. ^ Jeuken, Lars JC (2016). 「タンパク質電気化学のための電極材料の構造と修飾」.バイオ光電気化学：バイオ電気化学からバイオ光起電へ. 生化学工学／バイオテクノロジーの進歩. 第158巻. Springer, Cham. pp.  43– 73. doi :10.1007/10_2015_5011. ISBN 9783319506654. PMID  27506830。
  2. ^ Jeuken, Lars JC (2009-09-23). 「膜貫通型酵素用電極」. Natural Product Reports . 26 (10): 1234–40 . doi :10.1039/b903252e. ISSN  1460-4752. PMID  19779638.
  3. ^ abc バード、アレン・J. (2001).電気化学的手法：基礎と応用. フォークナー、ラリー・R. (1944-) (第2版). ニューヨーク: ワイリー. ISBN 9780471043720. OCLC  43859504。
  4. ^ abcd Laviron, E. (1979). 「拡散のない電気化学システムにおける線形電位掃引ボルタモグラムの一般的な表現」. Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry . 101 (1): 19– 28. doi :10.1016/s0022-0728(79)80075-3.
  5. ^ Chen, Kaisheng; Hirst, Judy; Camba, Raul; Bonagura, Christopher A.; Stout, C. David; Burgess, Barbara. K.; Armstrong, Fr​​aser A. (2000-06-15). 「タンパク質中の埋もれた酸化還元中心へのプロトン移動の原子レベルで定義されたメカニズム」Nature 405 (6788): 814– 817. Bibcode :2000Natur.405..814C. doi :10.1038/35015610. ISSN  1476-4687. PMID 10866206.  S2CID 4303347  .
  6. ^ abc Plichon, V.; Laviron, E. (1976). 「薄層線形電位掃引ボルタンメトリーにおける不可逆化学反応に関連する2段階可逆電気化学反応の理論的研究」Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry . 71 (2): 143– 156. doi :10.1016/s0022-0728(76)80030-7.
  7. ^ ab Laviron, E. (1980). 「プロトン化反応が平衡状態にある場合の1e, 1H+表面電気化学反応（4員環四角形スキーム）の理論的研究」Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry . 109 ( 1–3 ): 57–67 . doi :10.1016/s0022-0728(80)80106-9.
  8. ^ abcd Léger, Christophe; Bertrand, Patrick (2008-07-01). 「機構研究のためのツールとしての酸化還元酵素の直接電気化学」(PDF) . Chemical Reviews . 108 (7): 2379– 2438. doi : 10.1021/cr0680742 . ISSN  0009-2665. PMID  18620368.
  9. ^ ab Armstrong, Fr​​aser A.; Camba, Raúl; Heering, Hendrik A.; Hirst, Judy; Jeuken, Lars JC; Jones, Anne K.; Le′ger, Christophe; McEvoy, James P. (2000-01-01). 「タンパク質における結合電子移動反応の速度論とエネルギー論に関する高速ボルタンメトリー研究」Faraday Discussions . 116 (116): 191– 203. Bibcode :2000FaDi..116..191A. doi :10.1039/b002290j. ISSN  1364-5498. PMID  11197478.
  10. ^ ab Savéant, Jean-Michel (2006), 『分子および生体分子電気化学の要素：電子移動化学への電気化学的アプローチ』John Wiley & Sons , p. 455, doi :10.1002/0471758078, ISBN 978-0-471-44573-9
  11. ^ Laviron, E. (1972). 「脱分極剤または電気化学反応生成物の吸着がポーラログラフ電流に及ぼす影響」Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry . 35 (1): 333– 342. doi :10.1016/s0022-0728(72)80318-8.
  12. ^ Elliott, Sean J; Léger, Christophe; Pershad, Harsh R; Hirst, Judy; Heffron, Kerensa; Ginet, Nicolas; Blasco, Francis; Rothery, Richard A; Weiner, Joel H; Armstrong, Fr​​aser (2002). 「酵素の触媒活性における最適な酸化還元電位の検出と解釈」Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics . 1555 ( 1– 3): 54– 59. doi : 10.1016/s0005-2728(02)00254-2 . PMID  12206891.
  13. ^ Fourmond, Vincent; Léger, Christophe (2017). 「吸着酵素および分子触媒のボルタンメトリーモデリング」(PDF) . Current Opinion in Electrochemistry . 1 (1): 110– 120. doi :10.1016/j.coelec.2016.11.002.
  14. ^ del Barrio, Melisa; Sensi, Matteo; Orain, Christophe; Baffert, Carole; Dementin, Sébastien; Fourmond, Vincent; Léger, Christophe (2018). 「太陽熱燃料を生産・利用するヒドロゲナーゼおよびその他の酵素の電気化学的研究」(PDF) . Accounts of Chemical Research . 51 (3): 769– 777. doi :10.1021/acs.accounts.7b00622. hdl :11380/1264300. ISSN  0001-4842. PMID  29517230. S2CID  3803863.
  15. ^ Murgida, Daniel H.; Hildebrandt, Peter (2005). 「電気化学界面におけるヘムタンパク質および酵素の酸化還元および酸化還元共役プロセス」. Physical Chemistry Chemical Physics . 7 (22): 3773–84 . Bibcode :2005PCCP....7.3773M. doi :10.1039/b507989f. ISSN  1463-9084. PMID  16358026.
  16. ^ Ash, Philip A.; Vincent, Kylie A. (2016).バイオ光電気化学：バイオ電気化学からバイオ光起電力へ. 生化学工学／バイオテクノロジーの進歩. 第158巻. Springer, Cham. pp.  75– 110. doi :10.1007/10_2016_3. ISBN 9783319506654. PMID  27475648。
  17. ^ Kornienko, Nikolay; Ly, Khoa H.; Robinson, William E.; Heidary, Nina; Zhang, Jenny Z.; Reisner, Erwin (2019年5月1日). 「酵素–電極界面の調査のための先進技術」. Accounts of Chemical Research . 52 (5): 1439– 1448. doi :10.1021/acs.accounts.9b00087. ISSN  0001-4842. PMC 6533600. PMID 31042353  . 
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