パルスチェイス分析
分子生物学における実験技術
シロイヌナズナ野生型およびaxr2-1変異体におけるオーキシンシグナル伝達のパルスチェイス解析。野生型およびaxr2-1の幼植物を35S-メチオニンで標識し、標識直後（t = 0）または非標識メチオニンで15分間チェイスした後（t = 15）にAXR2/axr2-1タンパク質を免疫沈降した。

パルスチェイス分析（PCA）は、タンパク質のライフサイクルを研究するために使用されます。パルスチェイス分析実験では、放射性標識や細胞毒性標識を用いてタンパク質を「タグ付け」します。一般的に用いられる方法としては、細胞をシクロヘキシミド（CHX）で処理してタンパク質合成を停止させる方法や、放射性同位体アミノ酸や緑色蛍光タンパク質（GFP）などのタンパク質を用いる方法などがあります。これらの標識は、タンパク質のライフサイクルを研究するために使用されます。[1]

パルスチェイス分析は主にタンパク質の研究に用いられますが、タンパク質と相互作用する様々な分子構造の研究にも用いることができます。タンパク質は、細胞のように分子構造に組み込まれている場合、あるいは高分子のようにより大きな構造の一部となっている場合など、様々な分子構造と相互作用することがあります。

生化学および分子生物学において、パルスチェイス分析は、細胞を標識化合物（パルス）に連続的に曝露し、次に同じ化合物を非標識の形で（チェイス）曝露することにより、時間の経過とともに起こる細胞プロセスを調べる方法です。[2]

機構

パルスチェイス実験は、「パルス」と「チェイス」の2つの部分に分かれています。「パルス」実験では、細胞のプロテオームを放射性アミノ酸で標識します。「チェイス」実験では、細胞によるアミノ酸の取り込みを阻害します。

パルスチェイス実験を開始するには、まず細胞を放射性アミノ酸の存在下で培養します。これは、細胞がアミノ酸をプロテオームに取り込むためです。研究者が細胞の一生（例えば、折り畳み、輸送、分解）を研究したい場合、実験の「チェイス」部分を開始します。チェイスを開始するには、細胞を非放射性同位体の存在下に置き、放射性同位体の取り込みを阻止します。次に、研究者はタンパク質が目的のプロセスにある間のチェイス時間を調べます。[3]

まず、選択された細胞または細胞群を、研究対象となる分子またはシステム（パルスラベリングも参照）に組み込む標識化合物（パルス）に曝露します。その後、化合物は代謝経路を経て、研究対象となる生成物の合成に利用されます。例えば、放射性標識されたロイシン（3 H-ロイシン）を膵臓β細胞群に供給すると、β細胞群はこのアミノ酸をインスリン合成に利用します。

パルスチェイス分析を補完するために、様々な実験技術が利用可能です。例えば、細胞染色、免疫沈降、SDS-PAGEなどが挙げられます。

標識化合物の導入直後（通常は約5分ですが、実際に必要な時間は研究対象によって異なります）、同じだが標識されていない物質（チェイス）を過剰量、環境に導入します。前述の例に従うと、インスリンの産生は継続しますが、パルスフェーズで導入された放射性ロイシンはもはや含まれず、放射性検出法では検出できません。しかし、パルス期間中に産生された標識インスリンの動きは、細胞内で追跡することができます。[4]

放射性物質および細胞毒性物質の除去

PCA法では、実験の「パルス」部分では放射性物質を用いてタンパク質を標識し、「チェイス」部分では細胞毒性物質を用いてタンパク質合成を停止させます。これは、実験中に使用される細胞にとって有害で​​す。研究者らは、毒性や放射性を持たない物質を用いる様々な方法を開発してきました。例えば、L-アジドホモアラニン（AHA）や4sUの使用などが挙げられます。AHAの例では、AHAを用いてタンパク質を標識します。その後、AHAはアルキン基と反応し、AHA標識タンパク質を単離します。この方法では、哺乳類細胞を0.5% SDS RIPA緩衝液とPBSで洗浄し、半減期と指数関数的減衰の式を用いて半減期を計算します。細胞内でタンパク質のミスフォールディングと熱ショックを誘発した後、細胞をパルスチェイス分析、SDS-PAGE、免疫ブロッティングにかけ、タンパク質の挙動を解析します。AHAは、放射性物質や細胞毒性物質の適切な代替法であることが示されています。放射性パルスチェイス分析と同等の結果が得られます。唯一の違いは哺乳類細胞を用いた場合に検出され、AHAは熱ショック応答を変化させる可能性があることが示されました。細胞生存率を決定するために、使用されるタンパク質、翻訳後修飾、および熱ショックを研究することで、細胞をさらに研究することができます。 [1] [5]

パルスチェイス解析は4sUでも用いられます。miRNAは転写後遺伝子制御に用いられ、細胞周期において大きな役割を果たします。miRNAは翻訳後修飾の大部分を占めていますが、その分解過程についてはあまり解明されていません。PCAにおけるmiRNAの初期量と実験終了時の量を比較すると、miRNA量が大幅に減少しています。miRNAは構造的に安定していますが、miRNAの半減期を測定することで、分解と減衰の兆候が見られます。このPCAでは、miRNAに4sUタグを付け、その「年齢」、つまりプリmiRNAか成熟miRNAかに基づいて分離しました。4sUをラベルとして、タンパク質処理後の成熟miRNAは、ラベルの分解量に基づいてプリmRNAから分離されました。miRNAの効率は、プリmiRNAと成熟mRNAの転写速度を比較することで、パルスチェイス解析によって決定することもできます。[1] [5]

物質の崩壊率への影響

PCA実験では、チェイスの長さを調べることでタンパク質の動態を解釈します。タンパク質の分解は多くの場合、指数関数的な減衰モデルに従いますが、指数関数的な減衰モデルに従わない場合、減衰曲線の予測に問題が生じます。タンパク質は外部要因がなくても時間の経過とともに分解しますが、パルスチェイス実験で使用される細胞毒性物質や放射性物質は、分解速度を上昇させます。減衰パターンは、チェイス終了時の分解タンパク質の量から決定されます。そのため、減衰速度を決定するには、正確な分解が重要です。非指数関数的な減衰パターンを考慮するために、パルス長と分子の減衰確率が考慮されます。実験データが収集された後、マルコフ連鎖を用いて減衰速度が表示されます。マルコフ連鎖は、イベントの確率を決定するための統計的手法です。PCAでは、マルコフ連鎖を用いて分子の寿命、年齢依存の減衰速度、および正確なパルス長を予測します。[6]

PCAで使用される手法

細胞染色

細胞分裂の方向は、PCAと細胞染色を用いて決定できます。細胞染色は、PCAと組み合わせて、仮説的な細胞プロセスを裏付け、視覚的なデータを提供するために使用されます。紡錘体などの細胞の様々な部分を染色することで、細胞周期の様々な段階を画像化できます。この情報は、対応する「パルス」期間と「チェイス」期間のデータと併せて使用されます。この実験では、5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）を用いてシロイヌナズナの葉細胞を標識しました。細胞核を染色し、染色信号とパルスチェイス信号を比較しました。細胞の分裂角度を用いて、細胞段階と細胞分裂の方向を決定しました。[7]

PCAを用いて細胞のライフサイクルの段階を決定することで、細胞小器官の形態を調べることができます。細胞は、DAPI、ヨウ化プロピジウム、ヘキストなどの様々な蛍光細胞染色剤で染色して、死細胞や細胞核を画像化することができます。この実験では、免疫標識と蛍光染色を併用しています。細胞はEdUで標識されています。この実験は植物細胞、具体的にはシロイヌナズナの根細胞で行われました。細胞は植物から単離され、EdUで免疫標識され、蛍光色素で染色されました。DAPIで画像化した細胞とPCAの結果を比較すると、細胞周期のG1後期にゴルジ体の量が増加することが示されました。[8]

免疫沈降法とSDS-PAGE

免疫沈降法は、溶液中に存在するタンパク質を特定するために用いられます。これは、タンパク質が構成する高分子の様々な構成要素を分解することによって行われます。PCA法では、PCAは、以前に標識されたタンパク質を回収し、タンパク質がタンパク質処理過程のどの段階にあるかを特定するために用いられます。タンパク質高分子はエンドグリコシダーゼ処理によって分解され、SDS-PAGEにかけられて個々のタンパク質の同定が行われます。この、存在する固有のタンパク質に関する情報は、特定の時点におけるタンパク質のメカニズムを解明するために用いられます。[3]しかし、標識タンパク質と非標識タンパク質の誤認の懸念があるため、免疫沈降法は常に用いられるわけではありません。[9]

PCA実験では、細胞から細胞外の残骸や、目的のタンパク質を単離する際に干渉したりノイズを発生させたりする可能性のある物質が洗浄されます。しかし、実験材料の洗浄には15分以上かかることがあります。細胞周期やタンパク質分解などの生物学的プロセスの特定の段階を調べようとする場合、細胞の洗浄にかかる時間が長くなると、実験結果に影響を及ぼす可能性があります。パルスチェイス実験は、洗浄を必要としないように変更できます。研究者らは、蛍光タンパク質と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を使用してタンパク質を標識する方法を開発しました。求核酵素を標識し、洗浄の代わりに、ノイズ干渉化合物を脱離反応によって除去しました。このPCAアプローチは、タンパク質発現の速度（[曖昧さ回避必要]）や移動などの時間依存的なタンパク質反応を明らかにすることができます。[10]

用途

この方法は、特定の細胞の活動を長期間にわたって測定するのに有用である。この方法は、プロテインキナーゼC、ユビキチン、その他多くのタンパク質の研究に用いられてきた。また、岡崎フラグメントの存在と機能を証明するためにも用いられた。ジョージ・パラデは、放射性アミノ酸のパルスチェイス法を用いて分泌経路を解明した。[11] [12]

健康科学

PCAは生物医学研究において様々な用途で利用されています。タンパク質を用いて、寿命やタンパク質と相互作用する構造を研究します。例としては、幹細胞、プロコラーゲン、細胞ターンオーバー、ウイルス封入体などが挙げられます。

細胞分裂とターンオーバー

パルスチェイス分析は、幹細胞の分裂速度を測定するために用いられます。幹細胞は通常の細胞とは異なり、ほとんど分裂しません。研究者たちは、マウスとラットの腎細胞を用いてパルスチェイス分析を行い、幹細胞の細胞周期と細胞寿命を研究してきました。標識保持細胞（LRC）が幹細胞であるかどうかを判断するために、異なるパルス長が使用されました。標識を長期間保持し、「遅い周期」を示す細胞は幹細胞であると仮定されました。パルスは、DNAアナログ標識の検出や、細胞の半減期を用いて細胞分裂回数の検出にも用いられました。[13]

細胞ターンオーバー速度はパルスチェイス分析によってモニタリングできます。研究者は、パルスチェイス分析とレーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析法（LAESI-MS）を組み合わせて、細胞ターンオーバー速度を機械的に増加させています。アミノ酸は、光合成緑藻類とクラミドモナス・ラインハルティの細胞に標識として用いられました。パルスチェイス分析は、同位体アミノ酸標識を追跡するために用いられました。これは細胞内の光合成速度と比較され、細胞のライフサイクルに関する知見に貢献しました。[14]

プロコラーゲン（タンパク質）

プロコラーゲンは、結合組織関連疾患において重要な役割を果たすため、研究対象となっています。プロコラーゲンはコラーゲンやタンパク質と相互作用し、小胞体やゴルジ体などの様々な細胞小器官を通過します。PCAは、プロコラーゲンの形成とその阻害を研究するために使用されます。PCAは、細胞の機能を阻害する可能性がないように、非放射性細胞を用いて行われます。この実験では、DNAへの損傷を避けるためにAHAも使用しています。細胞からプロコラーゲンを抽出するためにヒト細胞が使用されました。コラーゲンは蛍光色素で標識されました。染色とパルスチェイス標識に加えて、細胞からRNAを単離し、RT-qPCRを用いて、異なる時点におけるmRNAとコラーゲンの量を測定しました。[15] [16]

ウイルス封入体

パルスチェイス分析は、ウイルスがどのように複製し、細胞に侵入するかを解明するために用いられます。研究者は、インフルエンザAウイルス（IAV）の感染過程における細胞構造を研究するために、光活性化後蛍光消失（FLAPh）法を用いています。光退色後蛍光回復（FRAP）法とは異なり、FLAPh法は移動性要素を特定することができます。ウイルス感染は常に移動しているため、移動中のウイルスを画像化できる手法が必要です。FLAPh法はタンパク質成分を短時間のみ光退色させるため、タンパク質と細胞成分の位置を特定するのに適した手法です。この手法をパルスチェイス分析と組み合わせ、研究者は両方の視覚的手法を用いて、ウイルス感染の各段階におけるタンパク質の崩壊と細胞内におけるウイルスの位置を特定しました。[17]

研究

構造解析

PCAは、タンパク質と相互作用する分子の構造を決定するために使用できます。これは、タンパク質を標識し、実験におけるチェイスの長さを分析することによって行うことができます。また、パルスチェイス実験後のタンパク質の量と濃度を分析することによっても行うことができます。

バクテリオファージ

PCAはバクテリオファージの構造を決定するために使用できます。研究者たちはパルスチェイス分析を用いて、「パルス」と「チェイス」の間の遅延を調べることで、バクテリオファージT4の尾部の構造と形成過程を解明しました。この実験では、バクテリオファージのタンパク質をアミノ酸で標識しました。ファージは420個のタンパク質で構成されており、尾部タンパク質の位置はチェイスの長さによって決定されました。実験の「チェイス」とは、タンパク質がバクテリオファージ内で組み立てられるのにかかる時間の長さを観察したものです。タンパク質内で標識が「内側」へ進むほど、チェイスの長さは長くなります。標識されたタンパク質はゲル電気泳動によって同定されました。この手順は、バクテリオファージの尾部におけるタンパク質の順序が決定されるまで繰り返されました。[18]

高分子

タンパク質は、主成分分析（PCA）を用いて、より大きな高分子構造とどのように相互作用するかを研究します。これは、アミノ酸を翻訳開始点として用いることで行われます。標識タンパク質をmRNAに付加し、タンパク質の翻訳過程を追跡します。翻訳が停止した後も、タンパク質は翻訳後も追跡され、翻訳後の挙動が調べられます。標識タンパク質はタンパク質を単離するために使用でき、タンパク質を洗浄した後、免疫沈降法を用いて分析することで、タンパク質高分子複合体やその他の翻訳物質を同定することができます。[9]

参考文献

  1. ^ abc Morey, Trevor M.; Esmaeili, Mohammad Ali; Duennwald, Martin L.; Rylett, R. Jane (2021-09-07). 「SPAAC Pulse-Chase：細胞タンパク質の半減期を決定するための新規クリックケミストリーベースの手法」. Frontiers in Cell and Developmental Biology . 9 722560. doi : 10.3389/fcell.2021.722560 . ISSN  2296-634X. PMC 8452969.  PMID 34557490  .
  2. ^ 高橋正之、小野雄一 (2003). 「プロテインキナーゼCのパルスチェイス解析」.プロテインキナーゼCプロトコル. Methods Mol. Biol. Vol. 233. pp.  163– 70. doi :10.1385/1-59259-397-6:163. ISBN 978-1-59259-397-2. PMID  12840506。
  3. ^ ab Fritzsche, Susanne; Springer, Sebastian (2014). 「タンパク質合成と成熟の研究のためのパルスチェイス分析」 . Current Protocols in Protein Science . 78 (1): 30.3.1–30.3.23. doi :10.1002/0471140864.ps3003s78. ISSN  1934-3663. PMID  25367008.
  4. ^ Ferguson PL, Coombs DH (2000年3月). 「バクテリオファージT4テールの生体内集合のパルスチェイス解析」J. Mol. Biol . 297 (1): 99– 117. doi :10.1006/jmbi.2000.3551. PMID  10704310.
  5. ^ ab マルツィ、マッテオ J.;ジーニ、フランチェスコ。セルッティ、ベネデッタ。プレティス、ステファノ・デ;ボネッティ、パオラ。ジャコメリ、キアラ。ゴルスキー、マーシン M.クレス、テレジア。ペリッツォーラ、マッティア。ミュラー、ヘイコ。アマティ、ブルーノ。ニカシオ、フランチェスコ (2016-04-01)。 「新しいパルスチェイスアプローチによって明らかにされたマイクロRNAの分解ダイナミクス」。ゲノム研究。26 (4): 554–565。土井:10.1101/gr.198788.115。ISSN  1088-9051。PMC 4817778。PMID  26821571。 
  6. ^ Sin, Celine; Chiarugi, Davide; Valleriani, Angelo (2016-05-16). 「パルスチェイス実験による分解パラメータ」. PLOS ONE . 11 (5) e0155028. Bibcode :2016PLoSO..1155028S. doi : 10.1371/journal.pone.0155028 . ISSN  1932-6203. PMC 4868333. PMID 27182698  . 
  7. ^ Yin, Xiaofeng; Tsukaya, Hirokazu (2016). 「EdU標識アッセイにおけるパルスチェイス法は細胞分裂配向の迅速な定量化を可能にする」 . New Phytologist . 211 (4): 1462– 1469. Bibcode :2016NewPh.211.1462Y. doi :10.1111/nph.13980. ISSN  1469-8137. PMID  27121010.
  8. ^ Bourge, Mickaël; Fort, Cécile; Soler, Marie-Noëlle; Satiat-Jeunemaître, Béatrice; Brown, Spencer C. (2015). 「クリックEdUと光変換蛍光レポーターを組み合わせたパルスチェイス戦略：細胞周期中のゴルジ体タンパク質の動態追跡」 . New Phytologist . 205 (2): 938– 950. Bibcode :2015NewPh.205..938B. doi :10.1111/nph.13069. ISSN  1469-8137. PMID  25266734.
  9. ^ ab Stelter, Philipp; Kunze, Ruth; Radwan, Monika; Thomson, Emma; Thierbach, Karsten; Thoms, Matthias; Hurt, Ed (2012-09-14). 「パルスチェイスエピトープラベリングによる高分子アセンブリの時空間的生合成モニタリング」. Molecular Cell . 47 (5): 788– 796. doi :10.1016/j.molcel.2012.06.015. ISSN  1097-2765. PMID  22819325.
  10. ^ 水上 真; 渡辺 修二; 秋元 有里; 菊池 一也 (2012-01-25). 「設計蛍光プローブを用いたノーウォッシュタンパク質標識とリアルタイムパルスチェイス分析への応用」 . Journal of the American Chemical Society . 134 (3): 1623– 1629. Bibcode :2012JAChS.134.1623M. doi :10.1021/ja208290f. ISSN  0002-7863. PMID  22224915.
  11. ^ Hoyt MA, Zich J, Takeuchi J, Zhang M, Govaerts C, Coffino P (2006年4月). 「グリシン-アラニン反復配列はプロテアソームによる基質の適切な展開を阻害する」. EMBO J. 25 ( 8): 1720–9 . doi :10.1038/sj.emboj.7601058. PMC 1440830. PMID 16601692. 図表— パルスチェイス解析を示す  {{cite journal}}: （ヘルプ）内の外部リンク|quote=
  12. ^ Alberts, B. (2002年3月). 『細胞の分子生物学 第4版』 . Garland Science. ISBN 978-0-8153-3218-3。
  13. ^ Humphreys, Benjamin D. (2015-01-01). 「本題に入る：腎臓における標識保持細胞の脈拍測定」. American Journal of Physiology . 308 (1): F29– F30. doi :10.1152/ajprenal.00538.2014. ISSN  1931-857X. PMC 4281690. PMID  25298529 . 
  14. ^ Stopka, Sylwia A.; Mansour, Tarek R.; Shrestha, Bindesh; Maréchal, Éric; Falconet, Denis; Vertes, Akos (2016-01-01). 「レーザーアブレーション・エレクトロスプレーイオン化質量分析法とパルスチェイス分析による微生物のターンオーバー率」. Analytica Chimica Acta . 902 : 1– 7. Bibcode :2016AcAC..902....1S. doi :10.1016/j.aca.2015.08.047. ISSN  0003-2670. OSTI  1396748. PMID  26703248.
  15. ^ Mirigian, Lynn S.; Makareeva, Elena; Leikin, Sergey (2014-10-01). 「アジドホモアラニン標識によるプロコラーゲン生合成のパルスチェイス解析」.結合組織研究. 55 ( 5–6 ): 403–410 . doi :10.3109/03008207.2014.959120. ISSN  0300-8207. PMC 4254658. PMID  25159826 . 
  16. ^ Canty, Elizabeth G.; Kadler, Karl E. (2005-04-01). 「プロコラーゲンの輸送、処理、そして線維形成」 . Journal of Cell Science . 118 (7): 1341– 1353. doi :10.1242/jcs.01731. ISSN  0021-9533. PMID  15788652.
  17. ^ エティボル、テミトペ・アキグベ;パイシャン、ティアゴ。アモリン、マリア・ジョアン (2025)。 「光活性化後の蛍光損失 (FLAPh): ウイルス封入体の動態とダイナミクスを理解するためのパルスチェイス細胞アッセイ」。インフルエンザウイルス。分子生物学の方法 (ニュージャージー州クリフトン)。 Vol. 2890。125  ～ 140ページ。土井:10.1007/978-1-0716-4326-6_6。ISBN 978-1-0716-4325-9. ISSN  1940-6029. PMID  39890724.
  18. ^ Ferguson, Peter L.; Coombs, David H. (2000-03-17). 「バクテリオファージT4 tail1のin vivoアセンブリのパルスチェイス解析」 . Journal of Molecular Biology . 297 (1): 99– 117. doi :10.1006/jmbi.2000.3551. ISSN  0022-2836. PMID  10704310.
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