制限部位関連DNAマーカー
まず、ゲノムDNAを特定の制限酵素で消化し、DNAを断片化します。制限酵素断片長多型（RFLP）解析では、これらの断片をゲル電気泳動で可視化します。RADseqでは、制限酵素断片をシーケンシング装置（図示なし）で読み取り可能にするアダプターにライゲーションし、次に、選択したサイズ範囲の断片を次世代シーケンシング法を用いてシーケンスし、アライメントと比較を行います。

制限部位関連 DNA (RAD) マーカーは、関連マッピング、QTL マッピング、集団遺伝学、生態遺伝学、進化遺伝学に有用な遺伝子マーカーの一種です。遺伝子マッピングに RAD マーカーを使用することは、しばしば RAD マッピングと呼ばれます。RAD マーカーとマッピングの重要な側面は、RAD タグを単離するプロセスです。RAD タグは、ゲノム全体にわたる制限酵素の特定の制限部位の各インスタンスのすぐ両側にある DNA 配列です。 [ 1 ] RAD タグが単離されると、それらを使用して、主に一塩基多型 (SNP)の形で DNA 配列多型を識別し、遺伝子型を判定することができます。[ 1 ] RAD タグを分離して解析することで識別され、遺伝子型を判定される多型は、RAD マーカーと呼ばれます。シーケンスによる遺伝子型判定は、RAD-seq 法に似たアプローチですが、いくつかの重要な点で異なります。[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]

RADタグの分離

各制限酵素部位の周囲にあるDNA配列の利用は、RADタグの重要な側面である。[ 1 ]ゲノム中のRADタグの密度は、単離プロセスで使用される制限酵素に依存する。[ 5 ]制限酵素部位マーカー技術には、 RFLPや増幅断片長多型（AFLP）などがあり、これらは異なる制限酵素部位によって引き起こされる断片長多型を利用して遺伝的多型を区別する。RADタグ技術における隣接DNA配列の利用は、縮退表現法と呼ばれる。[ 2 ]

RAD タグを分離する最初の手順は、特定の制限酵素で DNA を消化し、ビオチン化アダプターをオーバーハングに連結し、DNA を制限部位間の平均距離よりもはるかに小さい断片にランダムに切断し、ビオチン化断片をストレプトアビジンビーズを使用して分離するというものでした。[ 1 ] この手順は、当初マイクロアレイ解析用に RAD タグを分離するために使用されました。[ 1 ] [ 6 ] [ 7 ]最近では、RAD タグ分離手順は、イルミナプラットフォームのハイスループット シーケンシングで使用するために変更され、生のエラー率が大幅に減少し、スループットが高くなるという利点があります。[ 5 ] この新しい手順では、DNAを特定の制限酵素（例：SbfI、NsiIなど）で消化し、P1と呼ばれる最初のアダプターをオーバーハングに連結し、DNAを制限部位間の平均距離よりもはるかに小さい断片にランダムに切断し、切断端を平滑末端に処理して2番目のアダプター（P2）を連結し、PCRを使用して両方のアダプターを含む断片を特異的に増幅します。重要なのは、最初のアダプターにMID（分子識別子）と呼ばれる短いDNA配列バーコードが含まれており、これは同じ反応で一緒にプールされ、配列決定された異なるDNAサンプルを識別するためのマーカーとして使用されることです。[ 5 ] [ 8 ] RADタグを解析するためにハイスループットシーケンシングを使用することは、縮小表現シーケンシングに分類でき、これにはRADSeq（RADシーケンシング）などが含まれます。[ 2 ]

RADマーカーの検出と遺伝子型判定

RADタグが単離されると、一塩基多型（SNP）などのDNA配列多型の同定と遺伝子型判定に使用することができます。[ 1 ] [ 5 ]これらの多型部位はRADマーカーと呼ばれます。RADタグを見つける最も効率的な方法は、ハイスループットDNAシーケンシング（[ 5 ] [ 8 ] RADタグシーケンシング、RADシーケンシング、RAD-Seq、またはRADSeqと呼ばれる）です。

ハイスループットシーケンシング技術が開発される以前は、RADマーカーはRADタグをマイクロアレイにハイブリダイズさせることで同定されていました。[ 1 ] [ 6 ] [ 7 ]マイクロアレイの感度が低いため、この手法では、制限酵素部位を破壊してRADタグの欠損につながるDNA配列多型、またはRADタグのハイブリダイゼーションを阻害する大きなDNA配列多型しか検出できません。そのため、マイクロアレイで達成できる遺伝子マーカー密度は、ハイスループットDNAシーケンシングで可能な密度よりもはるかに低くなります。[ 9 ]

歴史

RADマーカーは、最初にマイクロアレイを用いて実装され、その後NGS（次世代シーケンシング）に適応されました。[ 9 ]これは、2006年頃にオレゴン大学のエリック・ジョンソンとウィリアム・クレスコの研究室によって共同で開発されました。彼らは、ショウジョウバエにおける組換えブレークポイントの特定と、イトヨにおけるQTLの検出によって、RADマーカーの有用性を確認しました。[ 1 ]

ddRADseq

2012年には、改良型RADタグ法であるdouble digest RADseq（ddRADseq）が提案されました。[ 10 ] [ 11 ]ランダムな切断の代わりに2つ目の制限酵素を追加し、厳密なDNAサイズ選択ステップを加えることで、低コストで集団ジェノタイピングを行うことができます。これは、選択と集団分化、あるいは集団適応のための全ゲノムスキャンにおいて特に強力なツールとなり得ます。[ 11 ]

hyRAD

2016年の研究では、ハイブリダイゼーションRAD（hyRAD）と呼ばれる新しい方法が発表されました[ 12 ] 。この方法では、ゲノムのランダムな部分をカバーするビオチン化RAD断片が、ゲノムショットガンシーケンシングライブラリから相同断片を捕捉するための餌として使用されます。DNA断片は、最初に新鮮なサンプルに適用されたddRADseqプロトコルを使用して生成され、ハイブリダイゼーションキャプチャプローブとして使用されて、目的の断片でショットガンライブラリが強化されます。このシンプルで費用対効果の高いアプローチにより、非常に劣化したDNAサンプルからでも相同遺伝子座のシーケンシングが可能になり、ミュージオミクスの分野で新しい研究の道が開かれます。この方法のもう1つの利点は、制限部位の存在に依存しないため、サンプル間の遺伝子座のカバレッジが向上することです。この技術は、まず旧北区に生息するバッタの一種であるOedaleus decorusの博物館標本および新鮮な標本で試験され、その後、リージェントミツスイ[ 13 ]、節足動物[ 14 ]などにも適用されました。鳥類にhyRADを適用するための実験室プロトコルも開発されました[ 15 ] 。

参照

参考文献

  1. ^ a b c d e f g h Miller MR, Dunham JP, Amores A, Cresko WA, Johnson EA (2007年2月). 「制限酵素部位関連DNA（RAD）マーカーを用いた迅速かつ費用対効果の高い多型同定および遺伝子型判定」 . Genome Research . 17 (2): 240– 248. doi : 10.1101/gr.5681207 . PMC  1781356. PMID  17189378 .
  2. ^ a b c Davey JW, Hohenlohe PA, Etter PD, Boone JQ, Catchen JM, Blaxter ML (2011年6月). 「次世代シーケンシングを用いたゲノムワイド遺伝子マーカーの発見と遺伝子型判定」. Nature Reviews. Genetics . 12 (7): 499– 510. doi : 10.1038/nrg3012 . PMID 21681211. S2CID 15080731 .  
  3. ^ Campbell EO, Brunet BM, Dupuis JR, Sperling FA (2018). 「RRS を他の名前で呼んだ場合、RAD のように聞こえるだろうか？」生態学と進化の方法. 9 (9): 1920– 1927. doi : 10.1111/2041-210X.13038 .
  4. ^ Vaux F, Dutoit L, Fraser CI, Waters JM (2022). 「生物地理学のためのシーケンシングによる遺伝子型解析」 . Journal of Biogeography . 50 (2): 262– 281. doi : 10.1111/jbi.145 ​​16.
  5. ^ a b c d e Baird NA, Etter PD, Atwood TS, Currey MC, Shiver AL, Lewis ZA, et al. (2008). 「配列決定されたRADマーカーを用いた迅速なSNP発見と遺伝子マッピング」 . PLOS ONE . 3 (10) e3376. Bibcode : 2008PLoSO...3.3376B . doi : 10.1371/ journal.pone.0003376 . PMC 2557064. PMID 18852878 .  
  6. ^ a b Miller MR, Atwood TS, Eames BF, Eberhart JK, Yan YL, Postlethwait JH, Johnson EA (2007). 「RADマーカーマイクロアレイはゼブラフィッシュの変異の迅速なマッピングを可能にする」 . Genome Biology . 8 (6): R105. doi : 10.1186/gb-2007-8-6-r105 . PMC 2394753. PMID 17553171 .  
  7. ^ a b Lewis ZA, Shiver AL, Stiffler N, Miller MR, Johnson EA, Selker EU (2007年10月). 「Neurosporaにおける変異遺伝子座の迅速マッピングのための制限部位関連DNAマーカーの高密度検出」 . Genetics . 177 (2): 1163– 1171. doi : 10.1534/genetics.107.078147 . PMC 2034621. PMID 17660537 .  
  8. ^ a b Hohenlohe PA, Bassham S, Etter PD, Stiffler N, Johnson EA, Cresko WA (2010年2月). 「RADタグ配列を用いたイトヨの並列適応に関する集団ゲノミクス」 . PLOS Genetics . 6 (2) e1000862. doi : 10.1371/journal.pgen.1000862 . PMC 2829049. PMID 20195501 .  
  9. ^ a b Shendure J, Ji H (2008年10月). 「次世代DNAシーケンシング」. Nature Biotechnology . 26 (10): 1135– 1145. doi : 10.1038/nbt1486 . PMID 18846087 . S2CID 6384349 .  
  10. ^ Peterson BK, Weber JN, Kay EH, Fisher HS, Hoekstra HE (2012). 「二重消化RADseq：モデル種および非モデル種におけるde novo SNP発見およびジェノタイピングのための安価な方法」 . PLOS ONE . 7 (5) e37135. Bibcode : 2012PLoSO ...737135P . doi : 10.1371/journal.pone.0037135 . PMC 3365034. PMID 22675423 .  
  11. ^ a b Peterson BK, Weber JN, Kay EH, Fisher HS, Hoekstra HE (2012). 「二重消化RADseq：モデル種および非モデル種におけるde novo SNP発見およびジェノタイピングのための安価な方法」 . PLOS ONE . 7 (5) e37135. Bibcode : 2012PLoSO...737135P . doi : 10.1371/ journal.pone.0037135 . PMC 3365034. PMID 22675423 .  
  12. ^ Suchan T, Pitteloud C, Gerasimova NS, Kostikova A, Schmid S, Arrigo N, et al. (2016). Orlando L (ed.). 「RADプローブを用いたハイブリダイゼーションキャプチャ（hyRAD）―コレクション標本のゲノム解析を実行するための新ツール」 . PLOS ONE . 11 (3) e0151651. Bibcode : 2016PLoSO..1151651S . doi : 10.1371/journal.pone.0151651 . PMC 4801390. PMID 26999359 .  
  13. ^ Crates R, Olah G, Adamski M, Aitken N, Banks S, Ingwersen D, et al. (2019). Russello MA (編). 「遊牧民の鳴鳥における深刻な個体群減少のゲノム的影響」 . PLOS ONE . 14 (10) e0223953. Bibcode : 2019PLoSO..1423953C . doi : 10.1371/journal.pone.0223953 . PMC 6812763. PMID 31647830 .  
  14. ^ Faircloth, Brant C. (2017). Gilbert, M. (編). 「保存されたゲノム要素の特定とそれらを豊かにするためのユニバーサルベイトセットの設計」 . Methods in Ecology and Evolution . 8 (9): 1103– 1112. doi : 10.1111/2041-210X.12754 . ISSN 2041-210X . S2CID 51896564 .  
  15. ^ Olah G, Aitken N, Suchan T (2018-01-25). 「hyRAD for birds v1」 . Protocols.io . doi : 10.17504/protocols.io.mt2c6qe .
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