組み換え抗体
抗体フラグメントの種類

組み換え抗体は、組み換え抗体コード遺伝子を用いて産生される抗体断片である。[1]組み換え抗体は主に免疫グロブリン可変領域の重鎖と軽鎖からなる。組み換え抗体は医療と研究の両面で多くの利点があり、特定の標的に対する探索と新規産生の人気の対象となる。最も一般的に使用される形態は単鎖可変断片（scFv）であり、ヒト医療と研究で利用できる最も有望な特性を示している。[2]ハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体は、時間の経過とともに目的の抗体を産生する能力を失ったり、抗体が機能に影響を与える望ましくない変化を起こしたりする可能性があるのに対し、ファージディスプレイで産生される組み換え抗体は、高い特異性と低い免疫原性を維持している。[3] [4]

構造と特性

フォーマット

一般的に生産されている組み換え抗体には、いくつかの形式が知られています。これらは、Fab組み換え抗体、scFv、およびダイアボディです。[4] [5] [3]各形式は、用途においてわずかに異なる可能性があり、さまざまな研究分野やヒトおよび動物の医学で使用できます。[6]研究されているもう1つの可能性は、抗イディオタイプ抗体の開発です。抗イディオタイプ抗体は、別の特定の抗体のパラトープに結合します。したがって、患者の血清中の抗体の存在と薬物負荷を測定するために使用できます。[7]結合特異性に基づいて、3種類の抗イディオタイプ抗体を区別できます。これらは、前述の形式と部分的に重複します。古典的なもの、Fabフラグメント抗体を含むグループ、薬物結合部位の外側のイディオトープに結合する抗体、および標的に結合した薬物のすでに組み立てられた複合体にのみ結合する抗体です。[7]最も一般的に使用されるのは、scFv、Fabフラグメント、および二重特異性抗体です。

単鎖可変フラグメント（scFv）

scFvは、抗原結合能を持つ組換え抗体フォーマットの中で最も小さいものです。[8]分子量は約27kDaです。[9] scFvは、免疫グロブリン可変領域の軽鎖と重鎖から構成されています。2つの鎖は、フレキシブルペプチドリンカーによって連結されています。[2]フレキシブルペプチドリンカーは通常、短い配列の繰り返しで構成されています。この配列は4つのグリシンと1つのセリンで構成されており[5]、フラグメントの安定化を目的としています。[8] [10]機能性は、部位特異的な化学修飾、ペプチドタグの付加、または遺伝子との融合によって強化され、二機能性組換え抗体が作製されます。[9]製品の良好な機能性を確保するためには、結合活性を確立することが重要です。結合活性の測定には、ELISAアッセイが日常的に実施されています。[11]

Fabフラグメント

構造的には、Fabフラグメントは2組の可変成分と定常成分から構成され、2つのポリペプチド鎖を形成します。これらは一緒に安定した構造を形成します。[5]抗イディオタイプ抗体の一員であるFabフラグメント組換え抗体は、標的抗体のパラトープに直接結合します。つまり、薬物と結合部位を競合し、阻害機能を有します。Fabフラグメント抗体は、結合していない薬物や血清中の遊離薬物の検出に使用できます。[7] Fab抗体は、Fabフラグメントには存在しない抗体のFc領域への非特異的結合によって引き起こされる副作用を回避するためにも使用されています。 [5] IgG免疫グロブリンが治療やその他の特定の用途により適している場合、組換えFabフラグメントを組換えIgG型に変換する実験も行われています。この可能性により、潜在的な標的構造のプールがさらに広がります。[12]

二重特異性組換え抗体

scFvおよびFabフラグメントに加えて、ダイアボディまたは二重特異性組換え抗体は3番目に主要なフォーマットです。[5]二重特異性抗体は、1つの分子内に2つの異なる抗原結合特異性を組み合わせています。[10]二重特異性抗体は、標的分子を2つの異なる細胞に架橋し、直接的な細胞傷害を媒介するために使用されます。[13] [14]

生産と開発

組み換え抗体の生産

組み換え抗体の生産は、基本的に同様のワークフローに従います。目的の産物の配列を決定し、コドンを改良し、遺伝子合成と構築物の生成を行います。構築物が研究室に届けられると、発現構築物が生成され、トランスフェクションと呼ばれるプロセスで細胞培養に移されます。細胞培養で目的の組み換え抗体が生産されると、定期的に収集、精製、分析されるか、さらなる実験に使用されます。組み換え抗体の生産には、CHO細胞やHEK293細胞などの安定細胞株が使用されます。[4]哺乳類細胞培養の最適化により、HEK293細胞株やCHO細胞株からの抗体収量は12g/リットル以上に増加しました。[15]組み換え抗体生産の初期段階では、大腸菌（Escherichia coli）内で機能的なFv断片を組み立てることが重要でした。正しいフォールドは抗体の機能にとって不可欠です。[16]現代のscFv生産における2つ目の必須条件は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖から組み換え抗体をうまく組み立てることでした。[17]これらの2つの実験により、組み換え抗体は現代の形にまで発展し、改良されました。今日のin vitro生産プロセスでは、実験動物は不要です。動物への免疫付与とそれに続く安定したハイブリドーマ細胞株の作製とは異なり、合成抗体またはヒト抗体ライブラリーを使用することで、必要な資源と廃棄物が少なくなり、プロセス全体の持続可能性が向上します。[18]

ハイブリドーマ

モノクローナル抗体は、今日のヒト医療において多くの治療法に不可欠です。堅牢で、目的の抗体を安定的に生産することに成功した最初の技術は、ハイブリドーマ技術でした。比較的純粋で予測可能な抗体を大量に生産するハイブリドーマ細胞株は、1975年に初めて導入されました。[19]それ以来、ハイブリドーマ技術は、診断、治療、研究用途に至るまで、様々な用途に利用されてきました。科学的発見や数多くの治療戦略において紛れもない役割を果たしているにもかかわらず、ハイブリドーマ技術は、倫理的問題、標的タンパク質の発現の喪失や生産時間の長期化の可能性、そして最も重要な点として、前述のように患者におけるHAMAの発現など、研究者にとっていくつかの障害を提示しています。[4] [20]そのため、ハイブリドーマを補完、あるいは部分的に代替する別の方法が必要です。ハイブリドーマは、今日でも組換え抗体の作製に不可欠な要素であり、モノクローナル抗体の産生に依然として利用されています。モノクローナル抗体からは、Fabフラグメント、scFv、または体細胞融合抗体が二重特異性抗体として生成されます。[5]

ファージディスプレイ

現在、実験室で組み換え抗体を生産するために最も一般的に適用されている技術は、ファージディスプレイである。[2] [9] [10] [11] [21] [22]ファージディスプレイは、標的の組み換え抗体をバクテリオファージの表面で生産する方法である。これにより、組み換え抗体の迅速な生産と、実験室環境での容易な操作が可能になる。scFvとFabフラグメントの両方の組み換え抗体は、抗体ファージディスプレイを使用して日常的に生産されている。[10]考えられるすべてのファージディスプレイシステムの中で、最も普及しているのは大腸菌であり、その急速な増殖と分裂速度、および安価なセットアップと維持のために使用されている。[20]

エンジニアリングと開発

scFvフラグメントを設計するための2つの主要な戦略が報告されている。1つ目は、いわゆる非共線的アプローチである。これは、 2つの鎖のヘテロ二量体形成の原理に基づいている。非共線的アプローチは、2つの特異性を組み合わせたダイアボディ（diabody）および組換え抗体の産生につながる。2つ目は共線的アプローチと呼ばれ、2つの異なるscFvを生物学的に活性なタンパク質と融合させるプロセスである。[5]

医療および研究用途

組み換え抗体は、様々な疾患の研究から診断、そして治療に至るまで、幅広い用途で活用されています。その特異性と低い免疫原性により、従来の治療法に代わる優れた選択肢となり、特定の分子を標的とする精度を高め、副作用を回避します。

組み換え抗体は、がん[23] 、HIV [24] 、 単純ヘルペスウイルス（HSV）[22]などの治療薬として研究されてきました。scFvは、有望な結果を示しているユニバーサルキメラ抗原受容体（uniCAR）技術の非常に有望な治療アプローチの一部となっています。scFvは、標的抗原を発現する特定のがん細胞に免疫応答を誘導する標的モジュールの形でこの技術の一部です。[23] [25] [26] HIV治療の研究では、組み換え抗体はむしろ中和特性のために使用されます。[ 24] HSV感染についても同様です。特定の組み換え抗体は、HSVの宿主細胞への侵入を複雑にしたり、不可能にしたりする表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン（HSP）に結合するように設計

このセクションの冒頭で述べたように、組み換え抗体は診断にも用いることができ、そのような診断用途の一例として狂犬病ウイルスの検出が挙げられる。[3] [20] [27]現在の診断用抗体は期待されるほど正確ではないため、組み換え抗体は有望な代替手段となる。狂犬病感染症は曝露後すぐにしか治療できないため、正確で精密な診断が患者の生存に不可欠である。市販の抗体や一般的に入手可能な抗体と比較して、組み換え抗体は製造コストが安く、感染の判定精度も高い。組み換え抗体のもう一つの利点は、その後の治療の一環として中和抗体として応用できる可能性があることである。[20]

ヒトおよび動物医療における組換え抗体の可能性は、ごく少数の厳選された例からも明らかであるように、計り知れない。前述の通り、組換え抗体、特にファージディスプレイ法で開発された抗体は特異性が高く、優れた薬物動態を有しており、幅広い治療に利用できる可能性がある。しかしながら、ファージディスプレイ法で作製された組換え抗体がハイブリドーマ抗体の産生を完全に代替することは期待されておらず、また望ましいことでもないことを認識しておくことが重要である。[4]

組み換え抗体を使用する利点

組み換え抗体は、ヒトの医療や研究への応用に多くの利点をもたらす。第一に、動物の免疫化が必要ないため、倫理的問題が完全に排除される。組み換え抗体発現のためのCHO細胞の培養は、細胞構造が人体の構造に似ているため、抗体生産者にとって一般的な戦略である。そのサイズは完全抗体よりも小さく、特に2000nm未満であるが[28] 、 8nm以上であるため[29]、望ましいクリアランスである腎経路を通じて、容易かつ適時に生物から排除される。[28] [29]もう1つの大きな利点は一価性であり、これは、それらが非常に特異性が高く、単一の抗原に結合することを意味する。研究者らは、抗原結合以外の活性を持たない抗体を生産することに成功した。[9]組み換え抗体は配列が定義されているため、より信頼性が高く、再現性が高い。[4]組換え抗体は、その小さなサイズと相まって、高い特異性を有し、特定の部位に高度に特異的な薬剤を送達することができます。これは、組換え抗体が組織に浸透しやすいという性質がまさにその原因です。組換え抗体は、全長IgG免疫グロブリンよりも腫瘍組織への浸透性が高いことが報告されています。[30]また、サイズが小さいため、患者の体内での分布も良好です。 [1]ハイブリドーマ細胞株由来の抗体と比較して、組換え抗体は免疫原性、特に悪名高いヒト抗マウス抗体（HAMA）を引き起こしません。[4] [21]さらなる利点として、アフコシル化組換え抗体が癌治療に効果的に利用されていることが示されています。[31]

これらは患者への使用における主な利点です。しかし、組換え抗体の使用は、ハイブリドーマ細胞株由来の従来のモノクローナル抗体と比較して、製造段階においても有利です。ハイブリドーマ技術と比較して、製造ははるかに迅速で、製造工程をより適切に制御できます。さらに、組換え抗体は、適切なサイズと形状であれば、事実上あらゆる抗原に対して設計することができ、抗原のペプチド性に限定されるわけではありません。組換え抗体は、薬剤や毒素との融合体として使用することもでき、医療用途においてさらなる活用が期待されます。最後に、製造段階における組換え抗体の利点として、患者や研究者の現在のニーズに基づいて、組換え抗体を最適化および遺伝子工学的に設計できることが挙げられます。[4]ファージディスプレイを行うには経験豊富な技術者が必要であり、遺伝子合成およびコンストラクト生成のプロセスには、外注企業を介在させることがほぼ不可欠です。[1] [4]しかし、研究や診断用途に使用される動物由来抗体とファージディスプレイ由来の組み換え抗体を体系的に比較した結果、EU動物実験代替基準研究所（EURL ECVAM）は2020年5月に非動物由来抗体を支持する勧告を発表した。[32]これは主に、動物由来抗体とは対照的に、組み換え抗体は常に配列が定義されたタンパク質試薬であり、動物で作られた現在の研究用抗体に起因する品質問題の一部を排除できるという事実に基づいている。[33] [34]

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