逆行追跡

Technique for mapping neural circuits in the "upstream" direction, from target to source

逆行性トレーシングは、神経接続をその終点（シナプス）からその源（細胞体）まで追跡する神経科学の研究手法です。逆行性トレーシング技術により、神経系全体にわたる標的ニューロン集団とその入力との間の神経接続を詳細に評価できます。これらの技術により、特定の構造（目など）のニューロンと脳内の標的ニューロン間の接続を「マッピング」できます。反対の技術は順行性トレーシングで、神経接続をその源から終点（つまり細胞体からシナプス）まで追跡するために使用されます。順行性トレーシングと逆行性トレーシングのどちらの技術も、軸索輸送の可視化に基づいています。

テクニック

逆行性追跡は、細胞と注射部位の結合性を示すマーカーとしてウイルス株を用いるなど、様々な方法で達成できます。例えば、仮性狂犬病ウイルス（PRV；Bartha株）は、シナプス結合したニューロンの経路を上流に伝播する性質があり、その回路の性質を明らかにすることができるため、適切なトレーサーとして使用できます。^[1]^[2]

狂犬病は、感染細胞へのダメージが少なく、ニューロンのみに感染するという特異性があり、ニューロン間のウイルス拡散がシナプス領域に限定されているため、この回路追跡システムに効果的であることが示されています。^[3]これらの要因により、細胞に物理的な損傷を与えることなく、回路内の個々のニューロン接続を明らかにできる、非常に特異的な追跡が可能になります。^[要出典]

もう一つの手法は、麻酔をかけた動物の脳核に特殊な「ビーズ」を注入するものである。^[4]動物は数日間生存させられた後、安楽死させられる。投射源の細胞は、倒立蛍光顕微鏡を用いて観察される。^[要出典]

ウィッカーシャムらは、改変された狂犬病ウイルスを用いた特殊な技術を開発しました。このウイルスは単一の細胞に感染し、1つのシナプスを飛び越える能力を持っていたため、研究者はニューロンの局所的な接続性を調査することができました。^[5]

狂犬病ウイルス

狂犬病ウイルスは、標的ニューロンのシナプス終末または軸索に取り込まれた後、小胞に包まれ、軸索ダイニンを介して細胞体へと輸送される。野生型の狂犬病ウイルスでは、ウイルスは複製を続け、中枢神経系全体に広がり、最終的には脳全体に全身感染する。^[3]狂犬病ウイルスの糖タンパク質（Gタンパク質）をコードする遺伝子を欠損させることで、ウイルスの拡散は最初に感染した細胞のみに限定される。Gタンパク質を擬似的に改変し、その遺伝子をCre制御下に置くことで、ウイルスの経シナプス拡散を起源ニューロンへの単シナプス伝達に限定することができる。このウイルスの拡散は、緑色蛍光タンパク質などの蛍光遺伝子をウイルスカセットに添加する方法や免疫組織化学法などの方法によって可視化することができる。^[6]^[7]

仮性狂犬病ウイルス

ヘルペスウイルス科に属する仮性狂犬病ウイルスは、中枢神経系を通じて逆行性と順行性の両方の経路で拡散し、逆行性伝播では神経軸索を上行して細胞体および樹状突起へと伝播します。仮性狂犬病ウイルスPRV-Bartha株では、3つの主要な膜タンパク質遺伝子を欠損させることでウイルスの順行性伝播が阻害され、ウイルスDNAに蛍光を付与するなどの追加操作が可能になり、逆行性伝播経路の追跡が可能になります。^[8]

フッ素金

フルオロゴールドはヒドロキシスチルバミジンとしても知られ、非ウイルス性の蛍光逆行性トレーサーであり、その軸索上および樹状突起を横切る動きは蛍光顕微鏡または免疫組織化学によって視覚化できます。^[9]

参照

参考文献

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^ Enquist, LW (2002-12-01). 「中枢神経系における仮性狂犬病ウイルスの回路特異的拡散の利用：病因と回路トレーサーへの洞察」. The Journal of Infectious Diseases . 186 (Supplement_2): S209 – S214 . doi : 10.1086/344278 . ISSN 0022-1899. PMID 12424699.
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さらに読む

逆行性追跡は、以下の例を含め、幅広い神経科学研究で広く使用されています。

Song, Chenghui; Ehlers, Vanessa L.; Moyer, James R. (2015-09-30). 「痕跡恐怖条件付けは、下辺縁系および前辺縁系皮質における内側前頭前皮質-扁桃体基底外側複合体投射ニューロンの内因性興奮性を異なる形で調節する」Journal of Neuroscience . 35 (39): 13511– 13524. doi :10.1523/JNEUROSCI.2329-15.2015. ISSN 0270-6474. PMC 4588614. PMID 26424895 .
Bácskai, Tímea; Rusznák, Zoltán; Paxinos, George; Watson, Charles (2014-01-01). 「マウス後肢筋を支配する運動ニューロンの筋部位別組織：フルオロゴールド逆行性トレーシングを用いた定量的研究」. Brain Structure and Function . 219 (1): 303– 321. doi :10.1007/s00429-012-0501-7. hdl : 20.500.11937/26565 . ISSN 1863-2653. PMID 23288256. S2CID 17675285.
Schwarz, Lindsay A.; Miyamichi, Kazunari; Gao, Xiaojing J.; Beier, Kevin T.; Weissbourd, Brandon; DeLoach, Katherine E.; Ren, Jing; Ibanes, Sandy; Malenka, Robert C. (2015). 「中枢ノルアドレナリン回路の入出力構造のウイルス遺伝学的追跡」Nature . 524 (7563): 88– 92. Bibcode :2015Natur.524...88S. doi :10.1038/nature14600. PMC 4587569. PMID 26131933 .
大原真也; 佐藤翔; 筒井健一郎; ウィッター面野 P.; 飯島俊夫 (2013-11-06). 「ラットにおける背側および腹側歯状回への多シナプス入力の組織化：狂犬病ウイルスベクターを用いた逆行性トランスシナプス追跡」. PLOS ONE . 8 (11) e78928. Bibcode :2013PLoSO...878928O. doi : 10.1371/journal.pone.0078928 . ISSN 1932-6203. PMC 3819259. PMID 24223172 .
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[1] O'Donnell, P.; Lavín, A.; Enquist, LW; Grace, AA; Card, JP (1997). 「仮性狂犬病ウイルスの逆行性シナプス輸送によって明らかになったラット側坐核と視床間の相互接続された並列回路」Journal of Neuroscience . 17 (6): 2143– 2167. doi : 10.1523/jneurosci.17-06-02143.1997 . PMC 6793770 . PMID 9045740.

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[4] Katz, LC; Burkhalter, A.; Dreyer, WJ (1984-08-09). 「視覚皮質のin vivoおよびin vitro研究における逆行性神経マーカーとしての蛍光ラテックスマイクロスフィア」Nature 310 ( 5977 ): 498– 500. Bibcode :1984Natur.310..498K. doi :10.1038/310498a0. PMID 6205278. S2CID 36191957.

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[7] Huang, Z. Josh; Zeng, Hongkui (2013-07-10). 「マウスの神経回路への遺伝学的アプローチ」Annual Review of Neuroscience 36 : 183–215 . doi : 10.1146/annurev-neuro-062012-170307. PMID 23682658.

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[9] Naumann, T.; Härtig, W.; Frotscher, M. (2000-11-15). 「フルオロゴールドを用いた逆行性トレーシング：超微細構造レベルでのトレーサー検出法の相違と、長期研究におけるバックフィルドニューロンの神経変性変化」Journal of Neuroscience Methods . 103 (1): 11– 21. doi :10.1016/s0165-0270(00)00292-2. ISSN 0165-0270. PMID 11074092. S2CID 24155326.