細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識
SILACの原理。細胞は、通常のアルギニンを含む軽質培地（Arg-0、青色）または重質アルギニンを含む培地（Arg-6、赤色）で培養することにより、異なる標識が付けられます。アミノ酸がタンパク質に代謝的に取り込まれると、対応するペプチドの質量が変化（質量シフト）します。この質量シフトは、図示されている質量スペクトルからわかるように、質量分析計で検出できます。両方のサンプルを混合すると、質量スペクトルのピーク強度比が相対的なタンパク質存在量を反映します。この例では、標識されたタンパク質は両方のサンプルで同じ存在量（比率1）です。

細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識（SILAC ）は、非放射性同位体標識を用いてサンプル間のタンパク質存在量の差を検出する質量分析法に基づく技術である。[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]これは定量的プロテオミクスでよく用いられる方法である。

手順

2つの細胞集団を細胞培養で培養します。一方の細胞集団には、通常のアミノ酸を含む増殖培地を与えます。一方、もう一方の細胞集団には、安定（非放射性）重同位体で標識されたアミノ酸を含む増殖培地を与えます。例えば、培地には、通常の炭素12（12 C）の代わりに、6つの炭素13原子（13 C）で標識されたアルギニンを含めることができます。細胞がこの培地で増殖すると、すべてのタンパク質に重いアルギニンが取り込まれます。その結果、1つのアルギニンを含むすべてのペプチドは、通常のペプチドよりも6 Da重くなります。あるいは、 13 Cまたは15 Nで均一に標識することもできます。両方の細胞集団からのタンパク質を組み合わせて質量分析法で一緒に分析します。異なる安定同位体組成を持つ化学的に同一のペプチドのペアは、質量差によって質量分析計で区別できるためですこのようなペプチドペアの質量スペクトルにおけるピーク強度の比は、2つのタンパク質の存在比を反映しています。[ 5 ] [ 3 ]

アプリケーション

通常の炭素12（12 C）の代わりに9つの炭素13原子（13 C）で標識されたチロシンを組み込むSILACアプローチは、シグナル伝達経路におけるチロシンキナーゼ基質の研究に利用されてきました。[ 6 ] SILACは、細胞シグナル伝達、リン酸化などの翻訳後修飾、[ 6 ] [ 7 ]タンパク質間相互作用、遺伝子発現の調節を研究するための非常に強力な方法として登場しました。さらに、SILACは、分泌タンパク質と分泌経路の包括的な研究であるセクレトミクスでも重要な方法となっています。 [ 8 ]これは、培養細胞によって分泌されたタンパク質と血清汚染物質を区別するために使用できます。[ 9 ]これはまた、宿主と微生物を同時に標識するための「順方向+逆方向」SILAC法としても採用されており、これにより宿主-微生物相互作用の研究が可能になっています。[ 10 ]様々なアプリケーション向けのSILACの標準化されたプロトコルも公開されています。[ 11 ] [ 12 ]

パルスSILAC

パルスSILAC（pSILAC）はSILAC法のバリエーションであり、標識アミノ酸を増殖培地に短時間だけ添加します。これにより、生の濃度ではなく、de novoタンパク質産生の違いをモニタリングできます。 [ 13 ] [ 14 ]

NeuCode SILAC

従来、SILACにおける多重化のレベルは、利用可能なSILAC同位体の数によって制限されていました。最近、NeuCode（中性子エンコード）SILACと呼ばれる新しい技術により、代謝標識で達成可能な多重化のレベルが向上しました（最大4）。[ 15 ] NeuCodeアミノ酸法はSILACに似ていますが、標識に重いアミノ酸のみを使用する点で異なります。重いアミノ酸のみを使用することで、SILACに必要なアミノ酸を100%組み込む必要がなくなります。NeuCodeアミノ酸の多重化能力の向上は、安定同位体の余分な中性子による質量欠損を利用することによるものです。しかし、これらの小さな質量差は、高分解能質量分析計で分離する必要があります

参考文献

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  2. ^ Jiang H, English AM (2002). 「同位体標識ロイシンの取り込みによる酵母プロテオームの定量分析」. Journal of Proteome Research . 1 (4): 345– 350. doi : 10.1021/pr025523f . PMID 12645890 . 
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  14. ^チュア、ソン・リン;ヤム、ジョーイ・クオク・フン。ハオ、ピリャン。アダブ、スニル S.サリド、メイ・マーガレット。劉、楊。ギブスコフ、マイケル。シウ・クワン;トルカー・ニールセン、ティム;ヤン、リャン (2016-02-19)。「緑膿菌バイオフィルムにおける抗生物質耐性細菌集団の選択的標識と根絶」。ネイチャーコミュニケーションズ。7 (1) 10750.土井: 10.1038/ncomms10750。ISSN 2041-1723。PMC 4762895。  
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さらに詳しい情報

  • Ong SE, Kratchmarova I, Mann M (2003). 「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識（SILAC）における13C置換アルギニンの特性」Journal of Proteome Research . 2 (2): 173–181 . doi : 10.1021/pr0255708 . PMID  12716131
  • Ong SE, Mann M (2006). 「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識（SILAC）の実用的方法」Nature Protocols . 1 (6): 2650– 2660. doi : 10.1038/nprot.2006.427 . PMID  17406521. S2CID  10651610 .
  • Ong SE, Mann M (2007). 「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識と定量的プロテオミクス」.質量分析法による定量的プロテオミクス. Methods in Molecular Biology. Vol. 359. pp.  37– 52. doi : 10.1007/978-1-59745-255-7_3 . ISBN 978-1-58829-571-2 PMID  17484109
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