飽和突然変異誘発
タンパク質工学で使用される技術
理論上の10残基タンパク質における単一位置の飽和変異。野生型のタンパク質を上部に示し、Mは最初のアミノ酸メチオニン、*は翻訳終結を表す。5番目の位置における19個の変異体すべてを下部に示す。

飽和突然変異誘発、または部位飽和突然変異誘発 (SSM)、あるいは単に部位飽和は、タンパク質工学で使用されるランダム突然変異誘発技術であり、単一のコドンまたはコドンセットをその位置で可能なすべてのアミノ酸で置換します。 [1]部位飽和技術には、ペア部位飽和(ライブラリ内のすべての変異体の 2 つの位置を飽和する) からスキャン単一部位飽和(タンパク質の各サイトで部位飽和を実行し、ライブラリ サイズが 20 nになり、ここでnはタンパク質内のペプチドの数)、またはn部位飽和 (ペプチド内の n 個のサイトが部位飽和され、ライブラリ サイズが 20 nになり、ペプチドの長さがnであれば完全なランダム化が得られる) まで、多くのバリエーションがあります。

方法

部位特異的変異誘発ライブラリをクローニングする一般的な方法（縮重オリゴの使用）の図解。対象遺伝子は、テンプレートと完全に相補的な領域（青）と、テンプレートと1つ以上のヌクレオチドが異なる領域（赤）を含むオリゴを用いてPCR反応される。相補的でない領域に縮重を含むこのようなプライマーを多数、同じPCR反応にプールすることで、その領域に異なる変異を持つ多様なPCR産物が得られる（個々の変異体は以下で異なる色で示されている）。

飽和突然変異は、一般的に、プライマーにランダム化されたコドン（例：SeSaM）を使用した部位特異的突然変異PCRによって達成される[2]か、ランダム化されるコドンで使用される合成ヌクレオチドの混合物を使用した人工遺伝子合成によって達成される[3] 。

アミノ酸セットをコードするために、異なる縮重コドンを使用することができる。[1]一部のアミノ酸は他のアミノ酸よりも多くのコドンによってコードされるため、アミノ酸の正確な比率は等しくならない。さらに、通常は終止コドン（一般的には望ましくない）を最小限に抑える縮重コドンが使用される。したがって、完全にランダム化された「NNN」は理想的ではなく、より制限された代替の縮重コドンが使用される。「NNK」と「NNS」は20種類のアミノ酸すべてをコードできるという利点があるが、それでも3%の確率で終止コドンをコードしてしまう。「NDT」、「DBK」などの代替コドンは終止コドンを完全に回避し、主要な生物物理学的タイプ（アニオン性、カチオン性、脂肪族疎水性、芳香族疎水性、親水性、小型）をすべて網羅する最小限のアミノ酸セットをコードしている。[1]単一の縮重コドンのみを使用するという制限がない場合、バイアスを大幅に低減することができる。[4] [5]縮退コドンとそれに対応するアミノ酸を高度に制御できるようにするために、いくつかの計算ツールが開発された。[6] [7] [8]

縮重コドン コドン数 アミノ酸の数 停車回数 コード化されたアミノ酸
NNN 64 20 3 全20
NNK / NNS 32 20 1 全20
非破壊検査 12 12 0 RNDCGHILFSYV
DBK 18 12 0 ARCGILMFSTWV
NRT 8 8 0 RNDCGHSY

アプリケーション

飽和突然変異は、指向性進化のための変異体を生成するために一般的に使用されます。[9] [10]

参照

参考文献

  1. ^ abc Reetz, MT; Carballeira JD (2007). 「機能性酵素の迅速な指向性進化のための反復飽和変異誘発（ISM）」. Nature Protocols . 2 (4): 891– 903. doi :10.1038/nprot.2007.72. PMID  17446890. S2CID  37361631.
  2. ^ Zheng, Lei; Baumann, Ulrich; Reymond, Jean-Louis (2004-07-15). 「効率的なワンステップ部位特異的および部位飽和変異誘発プロトコル」. Nucleic Acids Research . 32 (14): e115. doi :10.1093/nar/gnh110. ISSN  0305-1048. PMC 514394. PMID 15304544  . 
  3. ^ Reetz, Manfred T.; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D.; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (2010-07-07). 「反復飽和変異誘発による酵素立体選択性の実験室進化の加速：従来法との厳密な比較」アメリカ化学会誌. 132 (26): 9144– 9152. doi :10.1021/ja1030479. ISSN  0002-7863. PMID  20536132.
  4. ^ Kille, Sabrina; Acevedo-Rocha, Carlos G.; Parra, Loreto P.; Zhang, Zhi-Gang; Opperman, Diederik J.; Reetz, Manfred T.; Acevedo, Juan Pablo (2013-02-15). 「飽和変異誘発法によるコンビナトリアルタンパク質ライブラリーのコドン冗長性とスクリーニングの労力軽減」ACS Synthetic Biology . 2 (2): 83– 92. doi :10.1021/sb300037w. PMID  23656371.
  5. ^ Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (2014年6月). 「MDC-Analyzer：連続部位を持つインテリジェントな変異誘発ライブラリーの構築のための新規縮重プライマー設計ツール」. BioTechniques . 56 (6): 301– 302, 304, 306– 308, passim. doi : 10.2144/000114177 . ISSN  1940-9818. PMID  24924390.
  6. ^ Halweg-Edwards, Andrea L.; Pines, Gur; Winkler, James D.; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (2016年9月16日). 「コドン圧縮のためのウェブインターフェース」. ACS Synthetic Biology . 5 (9): 1021– 1023. doi :10.1021/acssynbio.6b00026. ISSN  2161-5063. PMID  27169595.
  7. ^ Engqvist, Martin KM; Nielsen, Jens (2015-04-30). 「ANT: 自然遺伝子コードおよび拡張遺伝子コードにおける縮重コドンの生成と評価のためのソフトウェア」. ACS Synthetic Biology . 4 (8): 935– 938. doi :10.1021/acssynbio.5b00018. PMID  25901796.
  8. ^ Kell, Douglas B.; Day, Philip J.; Breitling, Rainer; Green, Lucy; Currin, Andrew; Swainston, Neil (2017-07-10). 「CodonGenie：最適化された曖昧コドン設計ツール」. PeerJ Computer Science . 3 : e120. doi : 10.7717/peerj-cs.120 . ISSN  2376-5992.
  9. ^ Chica, Robert A.; et al. (2005). 「酵素活性のエンジニアリングへの半合理的アプローチ：指向性進化と合理的設計の利点の融合」Current Opinion in Biotechnology . 16 (4): 378– 384. doi :10.1016/j.copbio.2005.06.004. PMID  15994074.
  10. ^ Shivange, Amol V; Marienhagen, Jan; Mundhada, Hemanshu; Schenk, Alexander; Schwaneberg, Ulrich (2009-02-01). 「タンパク質の指向性進化のための機能的多様性創出における進歩」Current Opinion in Chemical Biology . Biocatalysis and Biotransformation/Bioinorganic Chemistry. 13 (1): 19– 25. doi :10.1016/j.cbpa.2009.01.019. PMID  19261539.
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