第二高調波イメージング顕微鏡
顕微鏡画像技術

第二高調波イメージング顕微鏡（SHIM ）は、第二高調波発生（SHG）として知られる非線形光学効果に基づいています。SHIMは、細胞や組織の構造と機能を可視化するための実用的な顕微鏡イメージングコントラスト機構として確立されています。[1] 第二高調波顕微鏡は、入射光から第二高調波光を生成する標本の能力の変化からコントラストを取得します。一方、従来の光学顕微鏡は、標本の光学密度、経路長、または屈折率の変化を検出することでコントラストを取得します。SHGには、非中心対称分子構造を持つ材料を通過する強力なレーザー光が必要です。この分子構造は、固有のものであるか、電場などによって外部から誘導されます。[2]

SHG物質から放出される第二高調波光は、物質に入射する光の波長のちょうど半分（周波数が2倍）です。二光子励起蛍光（TPEF）も二光子過程ですが、TPEFは励起状態の緩和中にエネルギーの一部を失いますが、SHGはエネルギー保存則に従います。SHG光の生成には通常、ニオブ酸リチウム（LiNbO 3）、リン酸チタン酸カリウム（KTP = KTiOPO 4）、三ホウ酸リチウム（LBO = LiB 3 O 5）などの無機結晶が用いられます。SHGでは、入射光を周波数2倍にするために物質が特定の分子配向を持つ必要がありますが、一部の生物学的物質は高度に分極しており、かなり整然とした、中心対称性のない大きな構造を形成することがあります。コラーゲン、微小管、筋ミオシン[3]などの一部の生物学的物質はSHG信号を生成できますが、水でさえも特定の条件下では秩序化して第二高調波信号を生成するため、SH顕微鏡では分子を標識することなく表面電位を画像化できます。[2] SHGパターンは主に位相整合条件によって決まります。SHGイメージングシステムの一般的なセットアップでは、励起源としてチタンサファイアモードロックレーザーを備えたレーザー走査顕微鏡が使用されます。SHG信号は順方向に伝播します。しかし、いくつかの実験では、SHGによって生成された信号の波長の約10分の1程度の物体は、ほぼ等しい順方向信号と逆方向信号を生成することが示されています。

肝臓のコラーゲン（白で表示）の第二高調波画像

利点

SHIMは、生細胞および組織のイメージングにおいていくつかの利点を提供します。SHGは、蛍光顕微鏡などの他の手法のように分子の励起を伴わないため、分子は光毒性や光退色の影響を受けにくいです。また、多くの生物学的構造が強いSHG信号を生成するため、外因性プローブによる分子の標識化は不要で、生物システムの機能を変化させる可能性もありません。入射光に近赤外波長を使用することで、SHIMは厚い組織の深部までをイメージングし、標本の3次元画像を 構築することができます。

二光子蛍光（2PEF）との相違点と相補性

二光子蛍光（2PEF ）はSHGとは全く異なるプロセスです。電子を高エネルギー準位に励起し、その後光子放出によって脱励起されます（SHGとは異なり、2光子プロセスでもあります）。したがって、2PEFは空間的（等方的に放出される）および時間的（サンプルに依存する広いスペクトル）に非コヒーレントなプロセスです。また、SHGとは異なり、特定の構造に特異的ではありません。[4]

そのため、多光子イメージングにおいてSHGと組み合わせることで、組織中のエラスチンのような自己蛍光を発する分子を明らかにすることができる（SHGは例えばコラーゲンやミオシンを明らかにする）。 [4]

歴史

SHG がイメージングに使用される以前、1961 年にミシガン大学アナーバー校の PA Franken、G. Weinreich、CW Peters、および AE Hill によって石英サンプルを使用して最初の SHG のデモンストレーションが行われました。[5] 1968 年には、界面からの SHG が Bloembergen によって発見され[6]、それ以来、表面の特性評価や界面ダイナミクスの調査のツールとして使用されています。1971 年には、Fine と Hansen が生物組織サンプルから SHG を観察した最初のことを報告しました。[7] 1974 年には、Hellwarth と Christensen が多結晶ZnSe からの SHG 信号をイメージングすることにより、SHG と顕微鏡法の統合を初めて報告しました。[8] 1977 年には、Colin Sheppardが走査型光学顕微鏡でさまざまな SHG 結晶をイメージングしました。[9] 1993年、ルイスは電場中のスチリル染料 の第二高調波応答を調べた。彼はまた、生細胞のイメージングに関する研究も示した。2006年、水谷悟郎グループは、1996年に発表された二光子広視野顕微鏡[10]を使用してSHGを検出できたにもかかわらず、大きなサンプルの観察に必要な時間を大幅に短縮する非走査型SHG顕微鏡を開発した。非走査型SHG顕微鏡は、植物デンプン[11]、[12]巨大分子[13]クモの糸[14] [15] などの観察に使用された。2010年には、SHGは動物全体の生体内イメージングに拡張された。[16] [17] 2019年には、農薬の有効性を評価する方法を提供するために、葉の表面で農薬を直接選択的にイメージングする用途に適用され、SHGの用途が広がった。[18]

定量測定

配向異方性

SHG信号は明確な偏光特性を持つため、SHG偏光 異方性は組織中のタンパク質の配向と組織化の程度を決定するために用いることができる。異方性方程式を用いると： [19]

私 p 1つの r − 私 p e r p 私 p 1つの r + 2 私 p e r p ＝ r {\displaystyle {\frac {I_{par}-I_{perp}}{I_{par}+2I_{perp}}}=r}

平行方向と垂直方向の偏光強度を取得する。値が高い場合は異方性配向を示し、値が低い場合は等方性構造を示す。CampagnolaとLoewによる研究[19]では、コラーゲン繊維は値が高いほど整列した構造を形成することが明らかになった。 r {\displaystyle r} r {\displaystyle r} r ＝ 0.7 {\displaystyle r=0.7}

前方から後方へのSHG

SHGはコヒーレントなプロセス（空間的および時間的）であるため、励起方向に関する情報を保持し、等方的に放射されることはありません。主に順方向（励起と同じ方向）に放射されますが、位相整合条件によっては逆方向にも放射されます。実際、信号変換が減少するコヒーレンス長は以下です。

l c ＝ 2 / Δ け {\displaystyle l_{c}=2/\デルタ k}

順方向では ですが、逆方向では となり、>>となります。したがって、厚い構造は順方向に優先的に現れ、薄い構造は逆方向に優先的に現れます。SHG 変換は最初の近似で非線形変換器の数の 2 乗に依存するため、厚い構造から放射された場合に信号が高くなり、したがって順方向の信号は逆方向よりも高くなります。ただし、組織は生成された光を散乱することがあり、順方向の SHG の一部が逆方向に再反射される可能性があります。[20] 次に、順方向と逆方向の比 F/B を計算することができ、[20]は SHG 変換器（通常はコラーゲン原線維）の全体的なサイズと配置の測定基準です。また、散乱体の面外角度が大きいほど、F/B 比が高くなることが示されています（[21]の図 2.14 を参照）。 Δ け ∝ 1 / （ n 2 ω − n ω ） {\displaystyle \Delta k\propto 1/(n_{2\omega }-n_{\omega })} Δ け b わ d ∝ 1 / （ n 2 ω + n ω ） {\displaystyle \Delta k_{bwd}\propto 1/(n_{2\omega }+n_{\omega })} l c {\displaystyle l_{c}} l c 、 b わ d {\displaystyle l_{c,bwd}}

偏光分解SHG

偏光測定法の利点は、2002年にストーラーらによってSHGと組み合わせられました。[22]偏光測定法は分子レベルでの配向と秩序を測定することができ、SHGと組み合わせることでコラーゲンのような特定の構造に特異性を持たせることができます。偏光分解SHG顕微鏡法（p-SHG）は、このようにSHG顕微鏡法の拡張版です。[23] p-SHGは別の異方性パラメータを定義します。[24]

ρ ＝ 私 p 1つの r 私 p e r p {\displaystyle \rho ={\sqrt {\frac {I_{par}}{I_{perp}}}}}

これはrと同様に、画像化される構造の主要な配向と無秩序性の尺度である。この実験は長い円筒状のフィラメント（コラーゲンなど）で行われることが多いため、この異方性は に等しいことが多い [ 25]。ここで、 は非線形磁化率テンソル、Xはフィラメントの方向（または構造の主方向）、YはXに直交し、Zは励起光の伝播である。画像のXY平面におけるフィラメントの配向ϕ は、 FFT解析によってp-SHGから抽出し、マップにまとめることもできる[ 25]。[26] ρ ＝ χ X X X （ 2 ） χ X はい はい （ 2 ） {\displaystyle \rho ={\frac {\chi _{XXX}^{(2)}}{\chi _{XYY}^{(2)}}}} χ （ 2 ） {\displaystyle \chi^{(2)}}

線維化の量子化

コラーゲン（特殊なケースですが、SHG顕微鏡では広く研究されています）は様々な形態で存在し、28種類あり、そのうち5種類は線維状です。課題の一つは、組織中の線維状コラーゲンの量を特定・定量化し、その進化や他の非コラーゲン性物質との関係を明らかにすることです。[27]

そのためには、SHG顕微鏡画像を補正し、SHG波長に存在する微量の残留蛍光やノイズを除去する必要があります。その後、マスクを適用することで、画像内のコラーゲンを定量化することができます。[27]他の量子化技術の中でも、この技術は、非常に複雑であるにもかかわらず、おそらく最も特異性、再現性、適用性が高い技術です。[27]

その他

また、この技術は、逆伝播する活動電位が電圧減衰なしに樹状突起棘に侵入することを証明するためにも用いられ、長期増強に関する将来の研究の確固たる基盤を確立しました。ここでのこの技術の用途は、標準的な二光子顕微鏡では達成できない精度で、微小な樹状突起棘における電圧を正確に測定する方法を提供することでした。[28]一方、SHGは近赤外光を可視光に効率的に変換し、画像誘導光線力学療法を可能にし、浸透深度の制限を克服します。[29]

画像化できる材料

第二高調波発生（SHG）顕微鏡で撮影した生物組織。（a）ヒト角膜の横断面。（b）ゼブラフィッシュの骨格筋（ミオシン）。（c）成体マウスの尾腱。（d）成熟馬の膝の表面軟骨。

SHG顕微鏡法とその拡張は、様々な組織の研究に使用できます。下図にいくつかの例を示します。細胞外マトリックス内のコラーゲンが依然として主要な用途です。コラーゲンは、腱、皮膚、骨、角膜、大動脈、筋膜、軟骨、半月板、椎間板などに存在します。

ミオシンは骨格筋や心筋でも画像化できます。

表 1: SHG で見える、または SHG を効率的に生成する材料。
タイプ 材料 見つかった場所 SHG信号 特異性
炭水化物 セルロース 木材、緑の植物、藻類。 通常のセルロースでは非常に弱いが[18]、結晶性セルロースやナノ結晶セルロースではかなり強い。 -
スターチ 主食、緑葉植物 かなり強い信号[30] カイラリティはミクロレベルとマクロレベルにあり、右回りまたは左回りの円偏光ではSHGが異なる。
巨大分子多糖類サクラン シアノバクテリア サクラン綿のような塊、繊維、キャストフィルムから フィルムからの信号は弱い[13]
タンパク質 フィブロインとセリシン クモの糸 かなり弱い [14]
コラーゲン[9] 腱、皮膚、骨、角膜、大動脈、筋膜、軟骨、半月板、椎間板、結合組織 かなり強力ですが、コラーゲンの種類によって異なります（原繊維、繊維を形成するか？） 非線形磁化率テンソルの成分は、、、であり、ほとんどの場合 、 ~および/~1.4である。 d 33 {\displaystyle d_{33}} d 31 {\displaystyle d_{31}} d 15 {\displaystyle d_{15}} d 31 {\displaystyle d_{31}} d 15 {\displaystyle d_{15}} d 33 {\displaystyle d_{33}} d 15 {\displaystyle d_{15}}
ミオシン 骨格筋または心筋[3] かなり強い 非線形磁化率テンソル成分は、、、～であるが、コラーゲンとは逆に、 / ～0.6 < 1で ある。 d 33 {\displaystyle d_{33}} d 31 {\displaystyle d_{31}} d 15 {\displaystyle d_{15}} d 31 {\displaystyle d_{31}} d 15 {\displaystyle d_{15}} d 33 {\displaystyle d_{33}} d 15 {\displaystyle d_{15}}
チューブリン 有糸分裂または減数分裂における微小管[31]または神経突起（主に軸索）[32] かなり弱い 効率的に生成するためには、微小管を整列させる必要がある。
鉱物 圧電結晶 非線形結晶とも呼ばれる 位相が合えば強力 位相整合の さまざまなタイプ、重要と非重要
極性液体 水 ほとんどの生物 ほとんど検出できない（広視野ジオメトリと超短レーザーパルスが必要[33]） 配向した水分子が位相整合条件を満たすため、静電場を直接測定することができる[34]

THG顕微鏡との結合

第三高調波発生（THG）顕微鏡は、横方向の界面と3次の非線形感受率に敏感であるため、SHG顕微鏡を補完することができます[35] [36] χ （ 3 ） {\displaystyle \chi^{(3)}}

アプリケーション

癌の進行、腫瘍の特徴

マンモグラフィの密度はコラーゲン密度と相関関係にあるため、SHGは乳がんの特定に使用できます。[37] SHGは通常、コヒーレント反ストークスラマン散乱や二光子励起顕微鏡などの他の非線形技術と組み合わせて、癌の可能性がある生検の非侵襲的で迅速な生体内組織学を提供する多光子顕微鏡検査（またはトモグラフィー）と呼ばれるルーチンの一部として使用されます。[38]

乳癌

前方および後方SHG画像の比較により、コラーゲンの微細構造についての洞察が得られ、それ自体が腫瘍のグレードとステージ、および乳房における腫瘍の進行に関連しています。[39] SHGと2PEFの比較では、腫瘍内のコラーゲンの配向の変化を示すこともできます。[40] SHG顕微鏡検査は乳がん研究に大きく貢献していますが、病院での信頼できる技術として、またはこの病理の一般的な診断として確立されていません。[39]

卵巣がん

健康な卵巣はSHGにおいて均一な上皮層と間質内に整然としたコラーゲンを呈するが、異常な卵巣は大きな細胞を持つ上皮と変化したコラーゲン構造を呈する。[39] r比（「配向異方性」を参照）は[41]、癌組織では原線維の配列が正常組織よりもわずかに高いことを示すためにも使用される。

皮膚がん

SHG は再び2PEFと組み合わされ、比率を計算するために使用されます。

M F S 私 ＝ （ シュグ − テペフ ） / （ シュグ + テペフ ） {\displaystyle MFSI=({\text{shg}}-{\text{tpef}})/({\text{shg}}+{\text{tpef}})}

ここで、shg（またはtpef）はSHG（または2PEF）画像における閾値処理されたピクセル数であり[42] 、 MFSIが高いほど純粋なSHG画像（蛍光のない画像）であることを意味する。MFSIが最も高いのは癌組織であり[39]、正常組織との鑑別のためのコントラストモードとして機能する。

SHGは第三高調波発生（THG）とも組み合わせられ、後方THG （前方SHGと後方SHGの比較参照）が腫瘍内で高いことが示されました。[43]

膵臓癌

膵臓癌におけるコラーゲンの超構造の変化は、多光子蛍光と偏光分解SHIMによって調べることができる。[44]

その他のがん

SHG顕微鏡検査は肺癌、結腸癌、食道間質癌、子宮頸癌の研究に報告されている。[39]

病理検出

コラーゲン原線維の組織や極性の変化は病理の兆候となり得る。[45] [46]

特に、コラーゲン繊維の異方性配列により、皮膚の健康な真皮と病的な瘢痕を区別することが可能になった。[47]また、変形性関節症などの軟骨の病理は、偏光分解SHG顕微鏡によって調べることができる。[48] [49] SHIMは後に線維軟骨（半月板）にも拡張された。[50]

組織工学

SHGは特定の分子を画像化する能力があり、顕微鏡を用いて、特定の組織の構造を、一度に一つの物質ずつ、様々なスケール（マクロからミクロまで）で明らかにすることができます。例えば、コラーゲン（I型）は、細胞の細胞外マトリックス（ECM）から、あるいはそれが組織内で足場や接合材として機能しているときに、特異的に画像化されます。[51] SHGはまた、絹のフィブロイン、筋肉のミオシン、そして生合成セルロースを明らかにします。こうした画像化能力はすべて、組織の特定の点を標的とすることで人工組織を設計するために使用できます。SHGは確かに、いくつかの方向、物質の量と配置を定量的に測定できます。[51]また、SHGを他の多光子技術と組み合わせることで、サンプルが比較的薄い場合でも、人工組織の発達をモニタリングすることができます。[52]もちろん、最終的には製造された組織の品質管理にも使用できます。[52]

目の構造

目の表面にある角膜は、十分に密度の高いコラーゲンの自己組織化特性により、合板のようなコラーゲン構造でできていると考えられています。[53]しかし、この組織におけるラメラ内のコラーゲンの配向は、まだ議論の的となっています。[54]円錐角膜の角膜も、コラーゲンの形態学的変化を明らかにするために、SHG で画像化することができます。[55]さらに、角膜の画像化には第三高調波発生(THG) 顕微鏡が使用され、この組織における THG と SHG の最大値は異なる場所にあることが多いため、これは SHG 信号を補完します。[56]

参照

出典

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