単一粒子の軌道

単粒子軌跡（SPT ）は、時間的に因果関係のある連続した離散点の集合から構成されます。これらの軌跡は 、実験データの画像から取得されます。細胞生物学の分野では、運動する分子に付着した小さな色素をレーザーで一時的に活性化することで、これらの軌跡が得られます。

分子は、最近の超解像顕微鏡に基づいて視覚化できるようになり、数千の短い軌道と長い軌道を日常的に収集できるようになりました。[ 1 ]これらの軌道は、膜上または3次元で細胞の一部を探索し、その経路は細胞内の局所的な混雑した組織と分子相互作用によって決定的に影響され、[ 2 ]ニューロン細胞、[ 3 ]アストロサイト、免疫細胞など、さまざまな細胞タイプで強調されています。

SPTは細胞内の分子の動きを観察し統計を収集することを可能にする

SPTは移動する粒子の観察を可能にした。これらの軌跡は細胞質や膜の組織化を調べるために使用されるが[ 4 ] 、細胞核のダイナミクス、リモデラーのダイナミクス、またはmRNAの産生を調べるためにも使用される。機器の絶え間ない改良により、空間分解能は継続的に低下しており、現在では約20nmの値に達している。一方、取得時間ステップは通常、生きた組織で起こる短いイベントを捉えるために10～50msの範囲である。超解像顕微鏡の変種であるsptPALMは、細胞内の分子の局所的かつ動的に変化する組織化や、哺乳類の核における転写因子によるDNA結合イベントを検出するために使用される。超解像画像の取得と粒子追跡は、高品質のデータを保証するために不可欠である[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]

追跡アルゴリズムに基づいて点を軌道に組み立てる

点群が取得されたら、次のステップは軌跡を再構築することです。このステップは、既知の追跡アルゴリズムを用いて取得された点群を繋ぎ合わせます。[ 8 ] 追跡アルゴリズムは、加法的なランダムノイズによって乱された軌跡の物理モデルに基づいています。

冗長SPTから物理パラメータを抽出する

多数の短い軌道（SPT）の冗長性は、分子レベルの経験的データから生物物理学的情報パラメータを抽出するための重要な特徴である。[ 9 ]対照的に、長い孤立した軌道は、軌道に沿った情報を抽出するのに用いられてきたが、これは様々な位置に関連する自然な空間的不均一性を破壊してしまう。主な統計ツールは、平均二乗変位（MSD）または2次統計モーメントを計算することである。

⟨|X（t+Δt）−X（t）|2⟩〜tα{\displaystyle \langle |X(t+\Delta t)-X(t)|^{2}\rangle \sim t^{\alpha }}[ 10 ] [ 11 ]（実現値）ここで、異常指数と呼ばれる。α{\displaystyle \alpha}

ブラウン運動の場合、となり、D は拡散係数、nは空間の次元です。長い軌跡からは、閉じ込められた運動の閉じ込め半径など、他のいくつかの特性も復元できます。[ 12 ] MSD は、生物学的な文脈において、必ずしも冗長ではない長い単一粒子軌跡の初期の応用で広く使用されてきた。しかし、長い軌跡に適用された MSD にはいくつかの問題があります。第 1 に、測定点が相関している可能性があるため、一部には正確ではありません。第 2 に、軌跡がスイッチング エピソード (自由拡散と閉じ込め拡散が交互に繰り返されるなど) で構成される場合は、物理的な拡散係数を計算するために使用することはできません。観測された軌跡の時空間解像度が低い場合、MSD は時間とともに線形以下になります。これは異常拡散と呼ばれるプロセスで、粒子運動のさまざまな位相が平均化されることに一部起因します。細胞輸送（アメーバ様体）の観点から、障害物を含むマイクロ流体チャンバー内の長いSPT [ 13 ]の高解像度運動解析により、異なるタイプの細胞運動が明らかになりました。障害物の密度に応じて、低密度では這うような運動が見られ、方向性のある運動とランダムな運動を区別することさえ可能です。 ⟨|X（t+Δt）−X（t）|2⟩＝2nDt{\displaystyle \langle |X(t+\Delta t)-X(t)|^{2}\rangle =2nDt}

冗長SPTから空間特性を回復するための物理モデル

運動モデルとしてのランジュバン方程式とスモルホフスキー方程式

SPTから情報を抽出するための統計的手法は、ランジュバン方程式やそのスモルホフスキーの限界、および追加の局在点識別ノイズやメモリカーネルを考慮した関連モデルなどの確率モデルに基づいています。[ 14 ]ランジュバン方程式は、ブラウン力と力場（静電力、機械力など）によって駆動される確率粒子を次の式で表します。 Ξ{\displaystyle \Xi}F（×、t）{\displaystyle F(x,t)}

メートルר+Γ×˙−F（×、t）＝Ξ、{\displaystyle m{\ddot {x}}+\Gamma {\dot {x}}-F(x,t)=\Xi ,}

ここで、mは粒子の質量、は拡散粒子の摩擦係数、粘性係数である。ここでは相関ガウス白色ノイズである。力はポテンシャル井戸Uから導かれ、その場合、方程式は以下の形をとる。 Γ＝6π1つのρ{\displaystyle \Gamma =6\pi a\rho }ρ{\displaystyle \rho }Ξ{\displaystyle \Xi}δ{\displaystyle \delta}F（×、t）＝−あなた′（×）{\displaystyle F(x,t)=-U'(x)}

メートルd2×dt2+Γd×dt+∇あなた（×）＝2εγdηdt、{\displaystyle m{\frac {d^{2}x}{dt^{2}}}+\Gamma {\frac {dx}{dt}}+\nabla U(x)={\sqrt {2\varepsilon \gamma }}\,{\frac {d\eta }{dt}},}

ここで、はエネルギーとボルツマン定数、Tは温度です。ランジュバン方程式は、慣性または加速度が重要となる軌道を記述するために使用されます。例えば、非常に短い時間スケールにおいて、分子が結合部位から解離したり、ポテンシャル井戸から脱出したりする場合[ 15 ]、慣性項によって粒子はアトラクターから離れることができ、数値シミュレーションに悪影響を与える可能性のある即時の再結合を防止します。 ε=kBT,{\displaystyle \varepsilon =k_{\text{B}}T,}kB{\displaystyle k_{\text{B}}}

大きな摩擦極限では、ランジュバン方程式の 軌跡は確率的にスモルホフスキー方程式の軌跡に収束する。γ→∞{\displaystyle \gamma \to \infty }x(t){\displaystyle x(t)}

γx˙+U′(x)=2εγw˙,{\displaystyle \gamma {\dot {x}}+U^{\prime }(x)={\sqrt {2\varepsilon \gamma }}\,{\dot {w}},}

ここで、は-相関しています。この式は、拡散係数が空間的に一定である場合に得られます。そうでない場合は、分子論的な考察から粗視化方程式（粗い空間分解能）を導出する必要があります。物理的な力の解釈は、伊藤の積分表現とストラトノビッチの積分表現、あるいはその他の表現では解決できません。 w˙(t){\displaystyle {\dot {w}}(t)}δ{\displaystyle \delta }

一般的なモデル方程式

素分子衝突よりもはるかに長い時間スケールにおいては、追跡粒子の位置は、ランジュバン確率モデルのより一般的な過減衰極限によって記述される。実際、経験的に記録された軌跡の取得時間スケールが熱揺らぎに比べてはるかに短い場合、データでは急速な事象は分解されない。したがって、この粗い時空間スケールでは、運動の記述は有効な確率方程式に置き換えられる。

X˙(t)=b(X(t))+2Be(X(t))w˙(t),(1){\displaystyle {\dot {X}}(t)={b}(X(t))+{\sqrt {2}}{B}_{e}(X(t)){\dot {w}}(t),\qquad \qquad (1)}

ここで、 はドリフトフィールド、 は拡散行列です。有効拡散テンソルは空間的に変化します （は の転置を表します）。この式は導出されたものではなく、仮定されたものです。しかし、拡散係数は十分に滑らかでなければなりません。なぜなら、D における不連続性は、不連続性の原因（通常は不活性な障害物または2つの媒体間の遷移）を解析するために空間スケーリングによって解決される必要があるからです。観測される有効拡散テンソルは必ずしも等方性ではなく、状態に依存する可能性があります。一方、摩擦係数は媒体が同じである限り一定であり、微視的な拡散係数（またはテンソル）は等方性を維持する可能性があります。 b(X){\displaystyle {b}(X)}Be{\displaystyle {B}_{e}}D(X)=12B(X)BTXT{\displaystyle D(X)={\frac {1}{2}}B(X)B^{T}X^{T}}XT{\textstyle X^{T}}X{\textstyle X}γ{\displaystyle \gamma }

これらの軌跡の統計分析

統計的手法の開発は、確率モデル、つまり軌跡に適用されるデコンボリューション手法に基づいています。数値シミュレーションは、単一粒子軌跡データから抽出できる特定の特徴を特定するためにも使用できます。[ 16 ] SPTデータから統計的アンサンブルを構築する目的は、速度、拡散、閉じ込め、吸引力など、粒子とその局所的なナノメートル環境との相互作用を反映する粒子の局所的な物理的特性を観察することです。確率モデルを用いることで、拡散係数（またはテンソル）から、異なるサイズの生物学的物体の存在を反映する障害物の閉じ込めまたは局所密度を構築することができます。

確率過程のドリフトテンソルと拡散テンソルの経験的推定量

局所的な拡散係数、ベクトル場、さらにはポテンシャル井戸のようなドリフト内の組織化されたパターンを復元するための経験的推定量がいくつか提案されている。[ 17 ]パラメトリック統計量とノンパラメトリック統計量から物理的特性を復元するための経験的推定量の構築。1次元時系列統計量から拡散過程の統計パラメータを復元するには、第一モーメント推定量またはベイズ推論が用いられる。

モデルと分析では、プロセスは定常的であり、軌跡の統計的特性は時間経過とともに変化しないと仮定しています。実際には、軌跡が1分未満で取得される場合、例えばニューロン表面にわずかな緩やかな変化しか生じないような場合、この仮定は満たされます。非定常的な動作は、連続した取得の間に数十分の遅延を設けたタイムラプス分析によって観察されます。

粗視化モデル式1は、軌道の条件付きモーメントから増分を計算することによって復元されます。 ΔX=X(t+Δt)−X(t){\displaystyle \Delta X=X(t+\Delta t)-X(t)}

a(x)=limΔt→0E[ΔX(t)∣X(t)=x]Δt,{\displaystyle a(x)=\lim _{\Delta t\rightarrow 0}{\frac {E[\Delta X(t)\mid X(t)=x]}{\Delta t}},}
D(x)=limΔt→0E[ΔX(t)TΔX(t)∣X(t)=x]2Δt.{\displaystyle D(x)=\lim _{\Delta t\rightarrow 0}{\frac {E[\Delta X(t)^{T}\,\Delta X(t)\mid X(t)=x]}{2\,\Delta t}}.}

ここでの表記は、時刻 tにおける点xのすべての軌跡を平均することを意味します。スモルホフスキー方程式の係数は、時刻 tにおける点xの近傍における軌跡の無限大のサンプルから、各点xにおける統計的に推定できます。 E[⋅|X(t)=x]{\displaystyle E[\cdot \,|\,X(t)=x]}

経験的推定

実際には、aとDの期待値は有限サンプル平均によって推定され、は記録された軌跡の時間分解能です。aとDの式は、任意のビンに含まれる数十から数百の点について、時間ステップ で近似されます。通常、これは推定には十分です。 Δt{\displaystyle \Delta t}Δt{\displaystyle \Delta t}

局所的なドリフト係数と拡散係数を推定するために、まず軌道を小さな近傍領域にグループ化する。観測領域は、辺rと中心の正方形のビンに分割され、各正方形について局所的なドリフト係数と拡散係数が推定される。サンプリング時刻がそれぞれである 軌道を持つサンプルを考えると、位置におけるドリフトの式は、x軸とy軸上の各空間投影について次のように 離散化される。S(xk,r){\displaystyle S(x_{k},r)}xk{\displaystyle x_{k}}Nt{\displaystyle N_{t}}{xi(t1),…,xi(tNs)},{\displaystyle \{x^{i}(t_{1}),\dots ,x^{i}(t_{N_{s}})\},}tj{\displaystyle t_{j}}a(xk)=(ax(xk),ay(xk)){\displaystyle a(x_{k})=(a_{x}(x_{k}),a_{y}(x_{k}))}xk{\displaystyle x_{k}}

ax(xk)≈1Nk∑j=1Nt∑i=0,x~ij∈S(xk,r)Ns−1(xi+1j−xijΔt){\displaystyle a_{x}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,{\tilde {x}}_{i}^{j}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}\left({\frac {x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j}}{\Delta t}}\right)}
ay(xk)≈1Nk∑j=1Nt∑i=0,x~ij∈S(xk,r)Ns−1(yi+1j−yijΔt),{\displaystyle a_{y}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,{\tilde {x}}_{i}^{j}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}\left({\frac {y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j}}{\Delta t}}\right),}

ここで、は正方形 に含まれる軌道点の数である。同様に、有効拡散テンソルの成分は経験的和で近似される。 Nk{\displaystyle N_{k}}S(xk,r){\displaystyle S(x_{k},r)}D(xk){\displaystyle D(x_{k})}

Dxx(xk)≈1Nk∑j=1Nt∑i=0,xi∈S(xk,r)Ns−1(xi+1j−xij)22Δt,{\displaystyle D_{xx}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j})^{2}}{2\,\Delta t}},}
Dyy(xk)≈1Nk∑j=1Nt∑i=0,xi∈S(xk,r)Ns−1(yi+1j−yij)22Δt,{\displaystyle D_{yy}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j})^{2}}{2\,\Delta t}},}
Dxy(xk)≈1Nk∑j=1Nt∑i=0,xi∈S(xk,r)Ns−1(xi+1j−xij)(yi+1j−yij)2Δt.{\displaystyle D_{xy}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j})(y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j})}{2\,\Delta t}}.}

モーメント推定には、各点を通過する多数の軌跡が必要です。これは、生物サンプルのsptPALM法によって取得されるような、特定の種類の超解像データによって生成される膨大なデータと正確に一致します。ラゲンバン方程式の正確な逆変換は、理論的には、任意の関心点xを通過する無限数の軌跡を必要とします。実際には、ドリフトテンソルと拡散テンソルの復元は、半径rの正方格子または移動スライディングウィンドウ（50～100 nm程度）によって領域を細分化した後に得られます。

ナノドメイン境界の自動回復

軌跡から抽出された点の密度をマッピングするアルゴリズムは、局所的な結合・輸送相互作用や、動的な細胞内部位の組織化を明らかにすることを可能にする。このアルゴリズムは、SPTによって明らかになる高密度領域の研究に適用できる。例としては、小胞体や細胞膜といった細胞小器官が挙げられる。この手法は時空間セグメンテーションに基づいており、数百ナノメートル単位の領域における高密度領域の局所的な構造と境界を検出する。[ 18 ]

参考文献

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