サウスウェスタンブロット
分子生物学技術
さまざまなブロッティング技術を捉えるコンパス

サウスウェスタンブロット法は、DNA結合タンパク質 [1]を特定のオリゴヌクレオチドプローブに結合する能力によって同定・特性評価する実験技術です。DNAに結合するタンパク質の分子量測定もこの技術で可能です。この名称は、それぞれDNAとタンパク質を検出するサザンブロッティング法とウェスタンブロッティング法の概念を組み合わせたものに由来しています。他の種類のブロッティング法と同様に、タンパク質はSDS-PAGEで分離され、その後ニトロセルロース膜に転写されます。サウスウェスタンブロット法は、最初のブロッティング法以来、結果を向上させる目的で多くの手法が提案・発見されてきたため、手順は多様化しています。以前のプロトコルは、大量のタンパク質が必要であり、分離中に タンパク質が分解されやすいという問題がありました。

サウスウェスタンブロッティングは、ブライアン・ボーエン、ジェイ・スタインバーグ、UK・レムリ、ハロルド・ウェイントラブによって1979年に初めて報告されました。[2]当時、この手法は「プロテインブロッティング」と呼ばれていました。DNAに関連するタンパク質を精製する手法は既に存在していましたが、望ましい結果を得るには、それらを組み合わせる必要が生じる場合が多かったのです。そこでボーエンらは、当時の既存の手法を簡素化できる手法を考案しました。  

方法

オリジナルの方法

SDS-PAGE法の一般的なセットアップのイメージ。電気泳動装置の組み立てから始まり、所定の緩衝液を添加します。次に、サンプルをゲルのウェルにロードします。電圧が正しく接続されていることを確認し、電気泳動が十分に進むまで待ちます。こうして、明確なバンドが形成されたゲルが生成されます。
SDS-PAGE電気泳動の概要

まず、対象となるタンパク質をSDS-PAGE法用に調製し、その後、分子サイズに基づいて分離するためにゲルにロードします。大きなタンパク質は、小さなタンパク質のように容易にゲルの細孔を通過することができないため、網目状のゲル構造を通過するのが困難です。その結果、大きなタンパク質はゲル上であまり遠くまで移動しませんが、小さなタンパク質はより遠くまで移動します。十分な時間が経過すると、ゲル電気泳動後の染色手順を複数回行うことで、明確なバンドが観察できるようになります。これらのバンドは、ロードされたウェルを基準としてゲル上の異なる位置にあります。

次に、タンパク質を再生させ、ゲルを2枚のニトロセルロースフィルターの間に挟んで押し付けます。このフィルターは拡散を利用してタンパク質をゲルからメンブレンフィルターへ移動させます。この時点でゲルのレプリカが作成され、それぞれが特定の目的を果たします。1枚のメンブレンフィルターは染色してゲル電気泳動で生成されたタンパク質バンドを観察し、もう1枚のメンブレンフィルターは、調製した32P放射性標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションの実際のプロセスに使用されます。[3]タンパク質とDNAの相互作用を検出するために、オートラジオグラフィーが一般的に用いられます。  

サウスウェスタンブロットマッピング

「サウスウェスタン ブロット マッピング」は、DNA 結合タンパク質とそれが相互作用するゲノム DNA 上の特定の部位を識別するための時間効率の高い方法です。

  1. まず、タンパク質を変性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に曝露する混合物を用いて調製します。この曝露により、タンパク質は折り畳まれた構造から折り畳まれていない構造へと変化するだけでなく、タンパク質間の電荷が均一になり、ポリアクリルアミドゲル（PAGE ）を用いたサイズに基づく分離が容易になります。
  2. 第二に、前のステップとは対照的に、得られたゲル上のタンパク質はSDSを除去することで元の状態に戻されます。これは、後の工程でタンパク質の相互作用を最大化するために理想的な状態に戻すためです。
  3. 3 番目に、拡散の方法と特性を使用して、ニトロセルロース膜上にブロッティングが行われます。
  4. 4 番目に、プローブの作成に移り、特定の制限酵素が選択され、調査対象の DNA 領域で使用され、適切だが異なるサイズの断片が生成されます。
  5. 第5段階として、断片は放射性標識され、事前に準備したブロットに結合するのに適切な時間を与えられます。この時間が経過したら、ブロットを洗浄し、結合できなかったDNAを除去します。
  6. 最後に、特異的に結合したDNAを各タンパク質-DNA複合体から溶出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を再度適用して分析する。[4]

結果

オリゴヌクレオチドプローブとの結合に時間をかけた後、メンブレンフィルター上のタンパク質の一部がプローブに結合していることを期待します。タンパク質に結合できなかったプローブは除去する必要があります。未結合プローブの除去が完了したら、メンブレンフィルターをより鮮明に観察するために、さらに様々な処理を行います。得られたメンブレンフィルターを、ゲルを挟んでいた2枚目のメンブレンフィルターと対応させることで、分子量ラダーと比較したタンパク質の位置から、プローブに結合したタンパク質の重量に関する情報が得られます。

方法の変更

  • 標準的な拡散法に頼ってタンパク質をゲルからフィルターへ移動させる代わりに、変性剤SDSを除去してタンパク質がフィルターへ移動する際に元の状態に戻すことができる電気ブロッティングが一般的に使用されています。[3]  
  • スキムミルクはウシ血清アルブミン（BSA）を含んでいるため、プローブとハイブリダイズする前にフィルターに加えられ、DNAとニトロセルロース膜との望ましくない、あるいは弱い相互作用を防ぎます。[2]
  • 迅速なジメチル硫酸（DMS）保護アッセイは、ブロット上の非特異的結合と特異的結合を識別するために使用できます。[5]
  • DNA プローブのハイブリダイゼーション ステップでは、DNA とタンパク質の間で発生する特定の相互作用を強化するために、一定量の塩が使用されます。  

利点、欠点、可能性

利点

  • サウスウェスタンブロッティングはタンパク質のDNAへの結合親和性を研究する上で有用であることから、この情報はDNAに結合する特定のタンパク質因子の発見にも活用できます。これらのタンパク質因子は、遺伝子発現の制御に関与している可能性があります。
  • 電気泳動移動度シフトやDNAフットプリンティングとは異なり、DNAに結合する未知のタンパク質の分子量を決定することができる。[3]  
  • ボーエンとその同僚は、DNA結合タンパク質を検出する手順だけでなく、RNA結合タンパク質やヒストン結合タンパク質を検出する手順も実験し実証した。[2]  
  • 結果は質量分析と組み合わせてDNA結合タンパク質の同定に役立てることができます。[6]
  • 等電点の測定は、標準的な1次元の代わりに2D-SDS-PAGEを使用することで可能である。 [6]

デメリット

  • この技術は、ドデシル硫酸ナトリウムがタンパク質を変性させる効果を利用するSDS-PAGEを使用するため、複数のサブユニットを持つタンパク質因子が分離する可能性があります。 [3]これは、この技術の後の段階でタンパク質因子がDNAに結合する程度に影響を与える可能性があります。
  • SDS-PAGEによる分離後、ニトロセルロース膜への転写プロセス中にすべてのタンパク質が再生するわけではありません。タンパク質再生のこの分野は、現在も実験段階にあります。
  • また、サウスウェスタンブロットを再利用し、廃棄前に様々なDNAプローブを用いてタンパク質を検査する実験も行われている。しかし、主な課題は、タンパク質の変性や抽出といったコストをかけずに、以前に使用したプローブをブロットから除去できる条件を規定するスキームを構築することである。[7]

潜在的

  • ブロットの再利用性の課題を克服することで、放射性標識を変えた特定のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、プローブの変異体がタンパク質と結合する程度を研究することが可能になります。[5]
  • オリゴヌクレオチドはSDS-PAGEのゲルを透過してタンパク質に結合することができないため、ブロッティング工程の重要性が強調されます。しかし、「タンパク質分離オリゴヌクレオチド透過性」ゲルが作製されれば、ブロッティング工程は不要になる可能性があります。このようなゲルを使用すれば、目的のオリゴヌクレオチドプローブがゲルに入り込み、タンパク質に結合するため、技術のステップ数を最小限に抑えながら、結果を一箇所で確認できます。[5]
  • 組織特異的なDNA結合タンパク質は、サウスウェスタンブロットマッピングによって同定できるという証拠があります。さらに、それらの配列特異的な結合は、対応する選択的に結合したDNA断片の精製を可能にし、DNA調節配列のタンパク質介在クローニングを改善する可能性があります。[4]

参考文献

  1. ^ 米国国立医学図書館医学件名表（MeSH）のSouthwestern+Blot
  2. ^ abc Bowen, B; Steinberg, J; Laemmli, UK; Weintraub, H (1980-01-11). 「タンパク質ブロッティングによるDNA結合タンパク質の検出」. Nucleic Acids Research . 8 (1): 1– 20. doi :10.1093/nar/8.1.1. ISSN  0305-1048. PMC 327239.  PMID 6243775  .
  3. ^ abcd Siu, Francis KY; Lee, Leo TO; Chow, Billy KC (2007-12-20). 「転写制御の調査におけるサウスウェスタンブロッティング」 . Nature Protocols . 3 (1): 51– 58. doi :10.1038/nprot.2007.492. ISSN  1754-2189. PMID  18193021. S2CID  21448484.
  4. ^ ab Lelong, Jean-Claude; Prevost, Grégoire; Lee, Kyong il; Crepin, Michel (1989年6月). 「サウスウェスタンブロットマッピング：DNA結合タンパク質とその特異的ゲノムDNA標的部位の同時特性評価法」 . Analytical Biochemistry . 179 (2): 299– 303. doi :10.1016/0003-2697(89)90132-2. PMID  2774177.
  5. ^ abc デイ、ビパシャ;トゥクラル、サミール。クリシュナン、シュルティ。チャクロバーティ、マイナク。グプタ、サヒル。マンガニ、チャンチャル。ラニ、ビバ (2012-06-01)。「DNA とタンパク質の相互作用: 検出と分析の方法」。分子および細胞生化学。365 (1): 279–299。土井:10.1007/s11010-012-1269-z。ISSN  1573-4919。PMID  22399265。S2CID 9743882  。
  6. ^ ab Jia, Yinshan; Nagore, Linda; Jarrett, Harry (2015). 「サウスウェスタンブロッティングアッセイ」. DNA-タンパク質相互作用. 分子生物学手法. 第1334巻. pp.  85– 99. doi :10.1007/978-1-4939-2877-4_5. ISBN 978-1-4939-2876-7. ISSN  1940-6029. PMC 4887086.  PMID 26404144  .
  7. ^ Jia, Yinshan; Jiang, Daifeng; Jarrett, Harry W. (2010年11月). 「アルカリホスファターゼストリッピングを用いたサウスウェスタンブロットの反復プロービング」. Journal of Chromatography A. 1217 ( 45): 7177– 7181. doi :10.1016/j.chroma.2010.09.033. ISSN  0021-9673. PMC 2964665. PMID  20926088 . 
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