超解像光揺らぎイメージング

超解像光変動イメージング( SOFI ) は、独立して変動する蛍光発光体の時間的相関に基づいて記録された画像時系列から超解像画像を計算する後処理方法です。

SOFIは、独立して変動する蛍光発光体（有機色素、蛍光タンパク質）で標識された生物学的標本の超解像用に開発されました。単一分子の局在に依存し、回折限界領域（DLA）および時点ごとに1つの活性分子のみを許容するSTORMまたはPALMなどの他の超解像顕微鏡技術と比較して、[1] [2] SOFIは制御された光スイッチングおよび/または光活性化、および長いイメージング時間を必要としません。 [3] [4]それでも、実際のオン/オフ状態または異なる蛍光強度の状態のいずれか、2つの区別可能な状態を循環する蛍光体が必要です。数学的に言えば、SOFIイメージングは​​キュムラントの計算に依存しており、2つの区別可能な方法が存在する理由です。一つには、画像は自己キュムラント[3]を用いて計算できます。自己キュムラントは定義上、各ピクセルの情報のみに依存します。もう一つは、クロスキュムラント[5]の計算によって異なるピクセルの情報を利用する改良された手法です。どちらの手法も、キュムラント計算には限界がありますが、最終的な画像の解像度を大幅に向上させることができます。実際、SOFIは3次元すべてにおいて解像度を向上させることができます。[3]

原理

SOFIの自己キュムラント計算の原理 （A）複数のエミッター信号を含むCCDピクセルグリッドの概略図（B）システムのPSFと畳み込まれた信号を持つ2つの蛍光体の切り出し画像スタックに記録（C）各ピクセルの信号はキュムラント計算（相関と積分の観点から理解できるプロセス）によって評価されます

他の超解像手法と同様に、SOFIはCCDカメラまたはCMOSカメラで画像の時系列を記録することをベースとしています。他の手法とは異なり、発光体の正確な位置特定が不要で、回折限界領域あたりの活性化蛍光体の数を多くできるため、記録される時系列は大幅に短くなります。SOFI画像のn次のピクセル値は、 n次のキュムラントの形でピクセル時系列の値から計算されますが、ピクセルに割り当てられる最終的な値は、相関関数の積分として考えることができます。最終的に割り当てられたピクセル値の強度は、蛍光信号の明るさと相関の尺度となります。数学的には、n次のキュムラントはn次の相関関数と関連していますが、画像の解像度に関していくつかの利点があります。SOFIではDLAごとに複数の発光体が許容されるため、各ピクセルにおける光子数は、近傍のすべての活性化発光体の信号の重ね合わせから得られます。キュムラント計算により信号はフィルタリングされ、相関の高い変動のみが残ります。これによりコントラストが向上し、バックグラウンドも低減されます。左の図に示されているように、蛍光源の分布は以下のようになります。

∑ け ＝ 1 北 δ （ r → − r → け ） ⋅ ε け ⋅ s け （ t ） {\displaystyle \sum _{k=1}^{N}\delta ({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{k}(t)}

システムの点像関数（PSF）U ( r )と畳み込みが行われる。したがって、時刻tと位置における蛍光信号は次のように表される。 r → {\displaystyle {\vec {r}}}

F （ r → 、 t ） ＝ ∑ け ＝ 1 北 あなた （ r → − r → け ） ⋅ ε け ⋅ s け （ t ） 。 {\displaystyle F({\vec {r}},t)=\sum _{k=1}^{N}U({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{k}(t)。}

上記の式において、Nは時間依存的な分子輝度を持つ位置に位置する発光体の数であり、は一定の分子輝度を表す変数であり、は時間依存的な変動関数である。分子輝度は、平均蛍光計数率を特定領域内の分子数で割った値である。簡略化のため、試料は定常平衡状態にあると仮定する。したがって、蛍光信号は平均ゼロの変動として表すことができる。 r → け {\displaystyle {\vec {r}}_{k}} ε け ⋅ s け {\displaystyle \varepsilon _{k}\cdot s_{k}} ε け {\displaystyle \varepsilon _{k}} s け （ t ） {\displaystyle s_{k}(t)}

δ F （ r → 、 t ） ＝ F （ r → 、 t ） − ⟨ F （ r → 、 t ） ⟩ t {\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=F({\vec {r}},t)-\langle F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}

ここで は時間平均を表します。ここでの自己相関（例えば2次）は、ある時間遅れに対して以下のように演繹的に記述できます。 ⟨ ⋯ ⟩ t {\displaystyle \langle \cdots \rangle _{t}} τ {\displaystyle \tau}

δ F （ r → 、 t ） ＝ ⟨ δ F （ r → 、 t + τ ） ⋅ δ F （ r → 、 t ） ⟩ t {\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=\langle \delta F({\vec {r}},t+\tau )\cdot \delta F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}

これらの式から、光学系のPSFは相関の次数のべき乗で求められることがわかります。したがって、2次相関では、PSFはすべての次元にわたって係数 だけ減少します。その結果、SOFI画像の解像度はこの係数に応じて増加します。 2 {\displaystyle {\sqrt {2}}}

キュムラントと相関関係

ピクセル値の再割り当てに単純な相関関数のみを使用すると、エミッターの時間的変動の独立性が考慮され、相互相関項が新しいピクセル値に寄与しなくなります。高次の相関関数の計算は低次の相関の影響を受けますが、低次の相関項はすべて消滅するため、キュムラントを計算する方が優れているのはなぜでしょうか。

キュムラント計算

自己累積

計算上の理由から、高次キュムラントのすべての時間遅れをゼロに設定すると、n次の自己キュムラントの一般的な表現が得られる。[3]

あ C n （ r → 、 τ 1 … n − 1 ＝ 0 ） ＝ ∑ け ＝ 1 北 あなた n （ r → − r → け ） ε け n わ け （ 0 ） {\displaystyle AC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\sum _{k=1}^{N}U^{n}({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\varepsilon _{k}^{n}w_{k}(0)}

わ け {\displaystyle w_{k}} キュムラントの順序によって影響を受け、主にエミッターの変動特性に依存する特定の相関ベースの重み付け関数です。

非常に高次のキュムラントを計算し、それによってPSFのFWHMを縮小することには根本的な制限はないが、最終画像に割り当てられる値の重み付けに応じて実際的な制限がある。分子の輝度が高いエミッターは、高次で割り当てられたピクセルキュムラント値に関して大きな増加を示すが、このパフォーマンスは、異なるエミッターの変動の多様な出現から期待できる。したがって、結果として得られる画像の広い強度範囲が期待され、その結果、高次画像では暗いエミッターが明るいエミッターによってマスクされる可能性がある。[3] [5]自己キュムラントの計算は、数学的に非常に魅力的な方法で実現できる。n次のキュムラントは、モーメントからの基本的な再帰で計算できる[6]

K n （ r → ） ＝ μ n （ r → ） − ∑ 私 ＝ 1 n − 1 （ n − 1 私 ） K n − 私 （ r → ） μ 私 （ r → ） {\displaystyle K_{n}({\vec {r}})=\mu _{n}({\vec {r}})-\sum _{i=1}^{n-1}{\begin{pmatrix}n-1\\i\end{pmatrix}}K_{ni}({\vec {r}})\mu _{i}({\vec {r}})}

ここで、K はインデックスの位数のキュムラントであり、同様にモーメントを表します。括弧内の項は二項係数を表します。この計算方法は、標準的な公式を用いてキュムラントを計算する場合と比較して簡単です。わずかな計算時間でキュムラントを計算でき、適切に実装されているため、大きな画像における高次キュムラントの計算にも適しています。 μ {\displaystyle \mu}

交差キュムラント

SOFIクロスキュムラント計算と距離係数の原理： （A）「繰り返しを含む組み合わせ」を用いた4次クロスキュムラント計算。（B）矢印に沿った距離係数の減衰。

より高度なアプローチでは、複数のピクセルの情報を考慮してクロスキュムラントを計算します。クロスキュムラントは以下のように記述できます。[5] [7]

C C n （ r → 、 τ 1 … n − 1 ＝ 0 ） ＝ ∏ j < l n あなた （ r → j − r → l n ） ⋅ ∑ 私 ＝ 1 北 あなた n （ r → 私 − ∑ け n r → け n ） ε 私 n わ 私 （ 0 ） {\displaystyle CC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\prod _{j<l}^{n}U{\Bigg (}{\frac {{\vec {r}}_{j}-{\vec {r}}_{l}}{\sqrt {n}}}{\Bigg )}\cdot \sum _{i=1}^{N}U^{n}{\Bigg (}{\vec {r}}_{i}-{\frac {\sum _{k}^{n}{\vec {r}}_{k}}{n}}{\Bigg )}\varepsilon _{i}^{n}w_{i}(0)}

j、l、kは寄与ピクセルのインデックスですが、iは現在の位置のインデックスです。その他の値とインデックスは前述と同様に使用されます。この式を自己キュムラントの式と比較した場合の主な違いは、重み付け係数の出現です。この重み付け係数 (距離係数とも呼ばれる) は PSF の形状をしており、各ピクセルの寄与が距離に沿って PSF の形状で減衰するという意味で、相互相関ピクセルの距離に依存します。原則として、これはピクセルが離れるほど距離係数が小さくなることを意味します。相互キュムラント手法を使用すると、有効ピクセル サイズを縮小することで、ラベル付けされた標本に関する真の情報を明らかにする新しい仮想ピクセルを作成できます。これらのピクセルは、単純な補間から生成されるピクセルよりも多くの情報を保持します。 あなた （ r j − r l / n ） {\displaystyle U(r_{j}-r_{l}/{\sqrt {n}})}

さらに、クロスキュムラント法は、前述のように相互相関の「損失」に起因する仮想ピクセルの強度差を利用することで、光学系のPSFを推定するために使用できます。[5]各仮想ピクセルは、ピクセルの距離係数の逆数で再重み付けすることができ、真のキュムラント値を復元できます。最後に、PSFを使用して「光学伝達関数」（OTF）を再重み付けすることで、 n次キュムラントのnの解像度依存性を作成できます。 [5]このステップは、PSFを用いて計算コストの低いデコンボリューションを行うことで置き換えることもできます。

クロスキュムラントの計算には、分割されたピクセルの合計を計算する、計算コストの非常に高い式の使用が必要となる。これは当然のことながら、異なるピクセルを組み合わせて新しい値を割り当てる必要があるためである。したがって、現時点では高速な再帰的アプローチは利用できない。クロスキュムラントの計算には、以下の式を用いることができる。[8]

K n （ r → ＝ 1 n ∑ 私 ＝ 1 n r 私 → ） ＝ ∑ P （ − 1 ） | P | − 1 （ | P | − 1 ） ! ∏ p ∈ P ⟨ ∏ 私 ∈ p F （ r → ） 私 ⟩ t {\displaystyle K_{n}{\Bigg (}{\vec {r}}={\frac {1}{n}}\sum _{i=1}^{n}{\vec {r_{i}}}{\Bigg )}=\sum _{P}(-1)^{|P|-1}(|P|-1)!\prod _{p\in P}{\Big \langle }\prod _{i\in p}F({\vec {r}})_{i}{\Big \rangle }_{t}}

この式において、P は可能な分割数、p は各分割の異なる部分を表します。さらに、i は計算中に考慮される異なるピクセル位置のインデックスです。F の場合、これは異なる寄与ピクセルの画像スタックに相当します。クロスキュムラント法は、前述のように、キュムラントの次数に応じて仮想ピクセルを生成することを可能にします。これらの仮想ピクセルは、下の画像（A）に示すように、4次クロスキュムラント画像において元のピクセルから特定のパターンで計算できます。このパターン自体は、元の画像ピクセル A、B、C、D のあらゆる可能な組み合わせを計算することで簡単に生成されます。ここでは、「繰り返しによる組み合わせ」という手法によって実現されています。仮想ピクセルは、相関自体に起因する強度の低下を示します。2番目の画像のBは、仮想ピクセルが相互相関にどのように依存するかを示しています。意味のあるピクセル値を復元するために、画像は仮想ピクセルグリッドの各ピクセルにPSF形状の距離係数を定義し、同じ距離係数に関連するすべての画像ピクセルに逆係数を適用するルーチンによって平滑化されます。[5] [7]

参考文献

  1. ^ Eric Betzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych, Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, Harald F. Hess:ナノメートル解像度での細胞内蛍光タンパク質の画像化 , Science , Vol. 313 no. 5793, 2006, pp. 1642–1645. doi :10.1126/science.11​​27344
  2. ^ S. vdLinde, A. Löschberger, T. Klein, M. Heidbreder, S. Wolter, M. Heilemann, M. Sauer:標準蛍光プローブを用いた直接確率的光学再構成顕微鏡法 , Nature Protocols , Vol. 6, 2011, pp. 991–1009. doi :10.1038/nprot.2011.336
  3. ^ abcde T. Dertinger, R. Colyer, G. Iyer, S. Weiss, J. Enderlein:高速、背景フリー、3D超解像光変動イメージング（SOFI） 、PNAS、Vol. 106 no. 52、2009、pp. 22287–22292。doi :10.1073/pnas.0907866106
  4. ^ S. Geissbuehler, C. Dellagiacoma, T. Lasser: SOFIとSTORMの比較 、Biomedical Optics Express、第2巻第3号、2011年、pp. 408–420. doi :10.1364/BOE.2.000408
  5. ^ abcdef T. Dertinger、R. Colyer、R. Vogel、J. Enderlein、S. Weiss：「超解像光揺らぎイメージング（SOFI）による解像度の向上とピクセル数の増加の実現」 、Optics Express、第18巻第18号、2010年、pp. 18875–18885。doi : 10.1364/OE.18.018875
  6. ^ PTスミス：「キュムラントからモーメントを求める問題とその逆の問題の再帰的定式化」 『アメリカ統計学者』第49巻第2号、1995年、217～218頁。doi :10.1080/00031305.1995.10476146
  7. ^ ab S. Geissbuehler, NL Bocchio, C. Dellagiacoma, C. Berclaz, M. Leutenegger, T. Lasser:バランス型超解像光変動イメージング（bSOFI）による分子統計のマッピング , Optical Nanoscopy , Vol. 1, 2012, pp. 1–4. doi : 10.1186/2192-2853-1-4
  8. ^ JM Mendel:信号処理とシステム理論における高次統計（スペクトル）に関するチュートリアル：理論的結果といくつかの応用 、IEEE紀要、第79巻第3号、1991年、pp. 278–297。doi :10.1109/5.75086
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