T7ファージ
バクテリオファージT7の原子分解能構造[ 1 ]
大腸菌ウイルスT7
ウイルスの分類この分類を編集する
（ランク外）: ウイルス
レルム: デュプロドナビリア
王国： 興公ビラエ
門: ウロウイルス門
クラス： カウドビリセテス
注文： オートグラフィウイルス科
家族： オートトランスクリプトウイルス科
属: テセプティマウイルス
種：
大腸菌ウイルスT7

バクテリオファージT7（またはT7ファージ）は、細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージです。ほとんどの大腸菌株に感染し、これらの宿主を増殖の基盤としています。バクテリオファージT7は溶菌性のライフサイクルを持ち、感染した細胞を破壊します。また、実験に理想的なファージとなるいくつかの特性を備えています。精製・濃縮によって化学分析において安定した値が得られること、[ 2 ]紫外線照射によって非感染性になること、[ 3 ] RNA結合タンパク質をクローニングするためのファージディスプレイに使用できることなどです。[ 3 ]

発見

T7は、1945年にミリスラフ・デメレックとウーゴ・ファノが行った研究で説明された7種類の溶菌ファージ（T1からT7）のうちの1つでした。[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] 7つのファージはすべて恣意的に番号が付けられていましたが、奇数番号のファージ、つまりT奇数ファージは、T偶数ファージと区別できる形態学的および生化学的特徴を共有することが後に発見されました。[ 7 ] T7に関する初期の研究は、1930年代にドイツ系アメリカ人の生物物理学者マックス・デルブリュックによって行われ、彼はそれをファージδと呼びました。[ 6 ]フランス系カナダ人の微生物学者フェリックス・デレルは、 1920年代にその近縁種を研究したと考えられます。[ 8 ] [ 6 ]

ホスト

T7は大腸菌の粗面株（すなわち、表面に全長O抗原多糖類を持たないもの）や他の腸内細菌で増殖しますが、近縁種は滑面株や莢膜株にも感染します。[ 9 ]

ウイルス粒子の構造

T7ウイルス粒子のカラー顕微鏡写真。6本の尾部繊維はカプシドに折り畳まれている。ウイルスが適切な宿主を見つけると、繊維は伸長する。
腸内細菌ファージT7ビリオンの注釈付き模式図（断面と側面図）

ウイルスは複雑な構造的対称性を持ち、ファージのカプシドは内径55nmの正二十面体（20面）で 、直径19nm、長さ28.5nmの尾部がカプシドに付着している。[ 10 ]感染時にカプシドからタンパク質が排出され、細胞内に侵入したウイルスの構造が変化する。[ 11 ]

バクテリオファージT7は、ゲノムワイドなタンパク質相互作用マップが作成された最初の生物である。55個のタンパク質間に25個の相互作用が明らかになり、そのほとんどは構造タンパク質とDNA複製に関与するタンパク質間であった。[ 12 ]

ゲノム

T7のゲノム[ 13 ]は、完全に配列された最初のゲノムの一つであり、1983年に公開されました。[ 14 ]ファージ粒子の頭部には、約56のタンパク質をコードする約40 kbpのdsDNAゲノムが含まれています。[ 15 ]ゲノムには多数の重複遺伝子が含まれています[ 16 ]が、T7.1を生成するためにゲノムの「リファクタリング」によって部分的に削除されました。[ 17 ]

T7ファージゲノムの模式図。四角は遺伝子、数字は遺伝子番号。色は図示のように機能グループを示す。白い四角は機能が不明な遺伝子、または注釈のない遺伝子。[6]より改変

ライフサイクル

T7のライフサイクルは37℃で17分、すなわち感染から宿主細胞が溶解し新たなファージが放出されるまでの時間である。潜伏期間が短いため、ほとんどの生理学的研究は感染細胞が30分後に溶解する30℃で実施されている。しかし、T7の高適応株は、最適な条件下で富栄養培地中で培養した場合、37℃でわずか約11分の潜伏期間で分離されている。この適応型ファージは、1時間の増殖で10の13乗以上まで効果的に増殖することができる。[ 18 ]

宿主細菌の感染

宿主細胞に感染するT7 。注釈付きの模式図。
T7ウイルス粒子の活動を示す断層画像。T7ウイルス粒子は繊維を使って細胞表面を「歩き回り」、最終的に細胞に感染します。
T7の再生サイクル全体
T7の複製機構の詳細

T7ファージは大腸菌細胞表面上の特定の受容体を認識し、ウイルス尾繊維を介して細胞表面に結合します。T7ファージの一部の株では、尾繊維が尾スパイクに置換されており、これが酵素活性によって細胞表面上のO抗原またはK抗原を分解します。[ 6 ]

吸着浸透プロセスでは、リゾチームを利用して細菌細胞壁のペプチドグリカン層に開口部を作り、ウイルスDNAを細菌内に導入する。T7様ファージの短くずんぐりとした尾部は細胞膜を越えるには短すぎるため、感染開始時にファージゲノムを細胞内に排出するためには、まずウイルス粒子タンパク質が尾部の先端から細胞質への経路を作らなければならない。[ 19 ] ファージはまた、ウイルスゲノムの複製を開始し、宿主ゲノムを切断するために必要な5つのタンパク質を放出する。[ 20 ] T7バクテリオファージは、ペプチドグリカン細胞壁やCRISPRシステムなど、宿主細菌の防御機構のいくつかを無効にするように進化してきた。[ 20 ] T7ファージがウイルスゲノムを挿入すると、宿主ゲノムのDNA複製プロセスが停止し、ウイルスゲノムの複製が開始されます。[ 21 ]

最適な条件下では、T7ファージは25分以内に溶菌プロセスを完了し、大腸菌宿主細胞を死滅させることができます。溶菌時には、ウイルスは100以上の子孫ウイルスを生成することができます。[ 20 ]

コンポーネント

Gp5（遺伝子gp5によってコードされる）はT7 DNAポリメラーゼである。T7 DNAポリメラーゼは、ファージDNA複製時に、大腸菌の内因性チオレドキシン（酸化還元タンパク質）をスライディングDNAクランプとして利用する（ただし、チオレドキシンは通常は異なる機能を有する）。スライディングクランプはポリメラーゼをDNAに保持する機能を持ち、これにより合成速度が向上する。[ 22 ]

DNA複製と修復

T7ファージは、DNAとATPまたはdTTPの存在下でヘキサマーを形成する単一のポリペプチド鎖に存在するヘリカーゼとプライマーゼからなる、最も単純なDNAレプリソームとして知られています。T7 DNAポリメラーゼは、大腸菌チオレドキシンの支援を受けて、リーディング鎖とラギング鎖の両方のDNA合成を行います。

T7ファージでは、DNA二本鎖切断は、切断部位のギャップにドナーDNAの一部を挿入することで修復されると考えられる。[ 23 ]この二本鎖切断の修復は、相同相補鎖DNAのアニーリングを促進する遺伝子2.5タンパク質によって促進される。[ 24 ]

複製中間体

細胞溶解後に引き伸ばされたT7ファージの複製細胞内DNAは通常、成熟ファージ染色体（11～15μM）よりも長く、成熟ファージ染色体の長さの最大66倍に及ぶ高度に連結した線状鎖の形で存在することがある。[ 25 ]複製DNAは、DNAの凝縮に必要な超らせん状のねじれが細胞溶解時の鎖切断によって解除された、多重ループDNA構成に対応すると思われるコイル状のリング構造の形でも見られる。[ 25 ]

分子生物学への応用

T7プロモーター配列は、T7 RNAポリメラーゼに対する親和性が非常に高く、高い発現レベルを示すため、分子生物学で広く使用されています。 [ 3 ] [ 2 ]

T7は合成生物学のモデルとして用いられてきた。Chanら（2005）はT7ゲノムを「リファクタリング」し、ゲノムの約12 kbpを改変DNAに置き換えた。 [ 17 ]改変DNAは、いくつかの方法で扱いやすくなるように設計された。個々の機能要素は、簡単に改変できるように制限酵素部位によって分離され、重複するタンパク質コードドメインは分離され、必要に応じて1塩基対のサイレント変異によって改変された。

参考文献

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