全反射蛍光顕微鏡

全反射蛍光顕微鏡( TIRFM ) は、通常 200 ナノメートル未満の標本の薄い領域を観察できるタイプの顕微鏡です。

TIRFMは、スライドガラス上に支持された薄い光学標本切片中の蛍光細胞の励起を利用するイメージング手法である。この技術は、励起光が透明な固体カバーガラスと液体媒体との界面で全反射すると、励起光と同じ周波数の電磁場（エバネッセント波とも呼ばれる）が固体-液体界面に発生するという原理に基づいている。^[1]エバネッセント波の強度は固体表面からの距離に応じて指数関数的に減衰するため、固体から数百ナノメートル以内の蛍光分子のみが効率的に励起される。これにより蛍光の2次元画像が得られるが、細胞内の小胞や構造の位置に関する3次元情報を取得できるメカニズムも存在する。^[2]

歴史

1910年には、試料全体を照射する光学技術である広視野蛍光法が導入されました。^[3]その後、1960年には共焦点顕微鏡が導入され、光をピンポイントに照射することで試料のバックグラウンドと露光時間を低減しました。1980年代には、TIRFMが導入され、検査対象の試料の薄い部分のみを照射することで、バックグラウンドと露光時間をさらに低減しました。^[3]

背景

TIRFM 用のエバネッセント波を生成する一般的な方法は 2 つあります。 ^[1] 1 つ目はプリズム法で、プリズムを使用してレーザーをカバーガラスと培地/細胞との界面に入射させ、全反射を引き起こすのに十分な入射角で照射します。この構成は 30 年以上にわたって細胞顕微鏡検査に応用されてきましたが、いくつかの制限のために主流のツールにはなりませんでした。プリズム構成には多くのバリエーションがありますが、そのほとんどは標本へのアクセスを制限し、操作の実行、標本空間への培地の注入、または生理学的測定の実行を困難にします。^[2]もう 1 つの欠点は、倒立顕微鏡設計に基づくほとんどの構成では、照明が対物光学系の反対側の標本側から導入されるため、標本の大部分を通過するエバネッセント場領域の画像化が必要になることです。このシステムの画像化には非常に複雑で精度が求められるため、プリズム法は多くの生物学者には使用されず、むしろ物理学者による使用に限られていました。

もう一つの方法は対物レンズ法として知られており、細胞顕微鏡におけるTIRFMの使用が増加しており、市販のソリューションが利用可能になって以来、さらに増加し​​ています。^[2]この機構では、対物レンズの後焦点面におけるビーム焦点の軸外位置を変更することで、標準的な広視野蛍光とTIRFを簡単に切り替えることができます。ビームの位置を変更する方法はいくつか開発されており、例えば、顕微鏡に取り付けられた蛍光照明装置に対する位置を変更できるアクチュエータを使用する方法などがあります。

応用

細胞生物学および分子生物学では、細胞接着、ホルモンによる細胞結合、神経伝達物質の分泌、膜ダイナミクスなど、細胞表面における多数の分子イベントが従来の蛍光顕微鏡を用いて研究されてきた。しかし、標本表面に結合した蛍光体と周囲の媒体中の蛍光体は平衡状態で存在する。これらの分子を従来の蛍光顕微鏡で励起して検出すると、表面に結合した蛍光体からの蛍光は、結合していない分子のほうがはるかに多いため、バックグラウンドの蛍光に圧倒されてしまうことが多い。TIRFM を使用すると、表面に結合した蛍光体を選択的に励起することができ、結合していない分子は励起されず、蛍光を発しない。サブミクロンの表面選択性という事実により、TIRFM は単一分子検出のための最適な方法となっている。

細胞顕微鏡におけるTIRFMの応用は多岐にわたります。その例としては、以下のようなものが挙げられます。

• リガンド結合と受容体の移動に応じた受容体エンドサイトーシスの動態を測定する
• エキソサイトーシス中の小胞に蛍光色素を充填してエキソサイトーシスイベントを観察する
• エンドサイトーシス/エキソサイトーシスにおける様々なタンパク質の役割を定性的および定量的に記述する
• 細胞と固体基質の接触領域の大きさ、動き、距離を観察する

TIRFMは、個々の小胞を光学的に分離し、それらの相互作用のダイナミクスを直接追跡する能力を備えており、これまでは不可能だった方法で神経生物学的プロセスに関与する膨大な数のタンパク質を研究する能力を提供します。^[2]

利点

TIRFM は、標準的な広視野および共焦点蛍光顕微鏡に比べて、次のようないくつかの利点があります。

• 背景が大幅に減少し、構造が明瞭に見えるようになります
• 焦点外の蛍光はほとんど収集されないため、ぼやけ効果が減少します。
• 細胞がさらされる光の量が大幅に減少し、細胞への光毒性が制限される。

概要

全反射を利用してガラスの表面に接触している細胞を照らすというアイデアは、1956 年に EJ Ambrose によって初めて説明されました。^[4]このアイデアは、1980 年代初頭にミシガン大学アナーバー校のDaniel Axelrod ^{[5]によって TIRFM として拡張されました。TIRFM は、}エバネッセント波を使用して、ガラスと水の界面に隣接する標本の限られた領域にある蛍光体を選択的に照射し励起します。エバネッセント電磁場は界面から指数関数的に減衰するため、サンプル媒体に浸透するのは約 100 nm の深さだけです。したがって、TIRFM を使用すると、細胞の基底細胞膜(厚さ約 7.5 nm) などの表面領域を選択的に視覚化できます。ただし、視覚化される領域の幅は少なくとも数百ナノメートルであるため、TIRF 顕微鏡検査中には、細胞膜に加えて、細胞膜のすぐ下の細胞質領域も必然的に視覚化されることに注意してください。細胞膜を選択的に可視化することで、生細胞の細胞膜上の特徴や事象を高い軸方向解像度で表現します。

TIRFは単一分子の蛍光を観察するためにも使用できるため[ ^{6] [7]、}生物物理学および定量生物学における重要なツールとなっています。TIRF顕微鏡は、DNAバイオマーカーの単一分子検出やSNP識別にも応用されています^{[8] 。}

シスジオメトリ（対物レンズを通したTIRFM）とトランスジオメトリ（プリズムとライトガイドをベースとしたTIRFM）は、全反射効果の質が異なることが示されています。トランスジオメトリの場合、励起光路と発光チャネルが分離されているのに対し、対物レンズ型TIRFMの場合は、顕微鏡の対物レンズとその他の光学要素が共有されます。プリズムベースのジオメトリは、きれいなエバネッセント波を生成することが示されており、その指数関数的減衰は理論的に予測された関数に近いです。^[9] しかし、対物レンズベースのTIRFMの場合、エバネッセント波は強い迷光によって汚染されています。迷光の強度はエバネッセント波の10～15％に達することが示されており、対物レンズ型TIRFMで得られたデータの解釈を困難にしています^{[10] [11]}

機構

（透過）全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）図

1. 客観的
2. 放射ビーム（信号）
3. イマージョンオイル
4. カバーガラス
5. 検体
6. エバネッセント波の範囲
7. 励起ビーム
8. 石英プリズム

TIRFM デバイスの基本コンポーネントは次のとおりです。

1. 励起ビーム光源
2. カバーガラスと浸漬油
3. 対物レンズ
4. サンプル標本
5. 検出器

客観ベースとプリズムベース

対物レンズベース（シス）TIRFMとプリズムベース（トランス）TIRFMの主な違いは、プリズムベースTIRFMではエバネッセント場を生成するためにプリズム／溶液界面を使用するのに対し、対物レンズベースTIRFMではプリズムを必要とせず、カバーガラス／溶液界面を用いてエバネッセント場を生成することです。一般的に対物レンズベースTIRFMの方が広く使用されていますが、エバネッセント波内の迷光ノイズの影響で画像品質が低下します。

プリズムベース

• 外部散乱が少ない
• はるかに安価（数千ドルではなく数百ドル）
• 低中倍率および水浸対物レンズに最適
• 自由コリメートレーザー光源で最も簡単
• より広い入射角範囲
  • 最小のエバネッセント場深度を達成することが望ましい

（シス）全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）図

1. 検体
2. エバネッセント波の範囲
3. カバーガラス
4. イマージョンオイル
5. 客観的
6. 放射ビーム（信号）
7. 励起ビーム

目的ベース

• 高倍率と高絞り
• 安定しており、セットアップと調整が簡単
• 自由平行レーザー、光ファイバー、または従来のアーク光源で動作します

方法論

基礎物理学

TIRFM は全反射という光学現象に基づいています。全反射では、媒体界面に到達した波は媒体 2 には透過せず、完全に反射して媒体 1 に戻ります。全反射には、媒体 2 の屈折率が媒体 1 よりも低く、波が界面に十分に斜めの角度で入射する必要があります。全反射に伴って観測される現象はエバネッセント波です。エバネッセント波は、界面から媒体 2 へと空間的に垂直に広がり、波長、屈折率、入射角に応じて指数関数的に減衰します。このエバネッセント波を利用して、サンプル表面近くの蛍光体の励起を高め、溶液内の余分な蛍光体の励起を減少させます。

実用上、対物レンズを用いたTIRFでは、媒質1は通常、高屈折率のガラスカバースリップであり、媒質2は溶液中の低屈折率のサンプルです。空気による大きな屈折を防ぐため、レンズとガラスカバースリップの間に浸漬油が使用される場合もあります。

エバネッセント波

励起光入射の臨界角はスネルの法則から導かれる。

${\displaystyle \theta _{c}=\sin ^{-1}\left({\frac {n_{1}}{n_{2}}}\right)}$

サンプルの屈折率については、カバーガラスの屈折率。 ${\displaystyle n_{1}}$ ${\displaystyle n_{2}}$

したがって、入射角が に達すると、全反射とエバネッセント波の効果が観察され始め、 を超えるとこれらの効果がより顕著になります。 ${\displaystyle \theta_{c}}$ ${\displaystyle \theta_{c}}$

エバネッセント波の強度は次のように表されます。

${\displaystyle I(Z)=I_{0}e^{-z/d}}$

侵入深さは次のように与えられます。 ${\displaystyle d}$

${\displaystyle d={\frac {\lambda _{0}}{4\pi}}\left(n_{2}^{2}\sin^{2}\theta -n_{1}^{2}\right)^{-1/2}}$

典型的には100ナノメートル以下であり、これは光の波長よりもはるかに小さく、共焦点顕微鏡のスライスよりもはるかに薄い。^{[1] [12]}${\displaystyle d}$

TIRFMイメージングでは、試料内の励起光の波長はフィルタリングによって選択できます。さらに、入射角の範囲は対物レンズの開口数（NA）によって決まり、NA > である必要があります。このパラメータは、励起光が対物レンズに入射する角度を変えることで調整できます。最後に、溶液とカバーガラスの反射率（）は、実験的に求めるか、メーカーから報告されています。 ${\displaystyle \lambda_{0}}$ ${\displaystyle \theta}$ ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle n}$

励起ビーム

複雑な蛍光顕微鏡技術においては、レーザー光源は均一性、強度、そしてほぼ単色性が高いため、好ましい光源です。ただし、ARCランプ光源やその他の光源も使用できる場合があります。励起光の波長は通常、サンプル内の蛍光色素分子の要件によって決定されますが、生物学的サンプルの場合、最も一般的な励起波長は400～700 nmです。

実際には、ライトボックスから高強度の多色レーザーを生成し、これをフィルタリングして必要な波長のみを透過させ、サンプルを励起します。対物レンズを用いたTIRFMでは、励起ビームと蛍光発光ビームを同じ対物レンズで捕捉します。そのため、ビームを分割するために、二色性ミラーを用いて入射励起ビームを対物レンズに向けて反射し、発光ビームを検出器に透過させます。発光波長と励起波長をさらに分離するには、追加のフィルタリングが必要になる場合があります。

放出ビーム

特定の波長の光で励起されると、蛍光色素はより長い波長（エネルギーが低い波長）の光を再放出します。TIRFM（全反射蛍光顕微鏡）の場合、界面に近い蛍光色素のみがエバネッセント場によって容易に励起され、約100nmを超える波長の蛍光色素は大きく減衰します。蛍光色素から放出された光は方向が定まらず、対物レンズを通過する際に様々な位置で様々な強度で透過します。この信号は二色性ミラーを通過し、検出器へと送られます。

カバーガラスと浸漬油

ガラスカバーガラスの屈折率は通常 程度ですが、浸漬油の屈折率は 程度です。空気の屈折率は であり、対物レンズとカバーガラスの間で励起ビームの屈折を引き起こす可能性があります。そのため、オイルは、ビームがカバーガラスとサンプルの界面に到達する前に、この領域を緩衝し、余分な界面相互作用を防ぐために使用されます。 ${\displaystyle n=1.52}$ ${\displaystyle n=1.51}$ ${\displaystyle n=1.00}$

対物レンズ

対物レンズの 開口数 (NA)は、システムが光を受け取ったり放出したりできる角度の範囲を指定します。

最大の入射角を達成するには、レンズの周辺部を軸外の角度で光を通過させることが望ましいです。

後焦点面（BPF）

後焦点面（「開口面」とも呼ばれる）は、励起ビームが対物レンズを通過する前に集束する面です。対物レンズとBPF間の距離を調整することで、入射角が小さくなったり大きくなったりするため、異なる結像倍率を得ることができます。ビームはBPFの両端で対物レンズを通過するために、軸外からBPFを通過する必要があり、これにより入射角が臨界角よりも十分に大きくなります。また、ビームはBPFで集束する必要があります。これは、対物レンズを通過する光がコリメートされ、カバーガラスと均一な角度で相互作用し、すべての光が全反射することを保証するためです。^[12]

サンプル

サンプルはカバースライドガラスの表面に吸着させ、適切な蛍光色素で染色することで、サンプル内の目的の特徴を分離します。これは、他の蛍光顕微鏡技術と同様のプロトコルです。

二色性（二色性）フィルター

ダイクロイックフィルターは、斜め入射角（通常45°）で使用されるエッジフィルターであり、励起帯域の光を効率的に反射し、発光帯域の光を透過します。フィルターの45°の角度は、励起光と発光光の経路を分離します。このフィルターは、薄いガラスに真空蒸着された金属、金属塩、誘電体の多層構造からなる複雑なシステムで構成されています。^[13]このコーティングは、短波長域では高い反射率、長波長域では高い透過率を持つように設計されています。^[14]フィルターは、選択された励起光（短波長域）を対物レンズを通して試料面に透過させると同時に、発光蛍光（長波長域）をバリアフィルターに通過させ、散乱した励起光をレーザー光源の方向に反射させます。^[15]これにより、フィルターを通過する励起光と、検出器で検出される発光蛍光の量が最大化されます。^[16]

バリアフィルター

バリアフィルターは主に不要な波長、特に短波長の励起光を遮断します。典型的にはバンドパスフィルターであり、蛍光体から放出される波長のみを通過させ、それ以外の不要な光はすべて遮断します。最新の顕微鏡では、蛍光体の特定の発光波長に応じてバリアフィルターを変更できるようになっています。^[13]

画像の検出と解像度

画像は電荷結合素子（CCD）デジタルカメラによって検出されます。CCDカメラには、薄いシリコンウエハーからなる光子検出器が搭載されており、光感度領域の2次元アレイとして組み立てられています。検出器アレイは、入射光の強度に応じて変化する局所的な電荷の形で画像情報を捕捉・保存します。^[2]図に示すように、光子は検出器によって電子に変換され、電子は回路基板で読み取り可能な電気信号に変換されます。^[17]次に、この電気信号は点像分布関数（PSF）と畳み込まれ、元の信号をサンプリングします。そのため、画像解像度は検出器の数に大きく依存し、点像分布関数によって画像解像度が決まります。^[18]

画像アーティファクトとノイズ

ほとんどの蛍光イメージング技術は、サンプルの大きなスライス（Z方向）を照明し、再構成するため、バックグラウンドノイズが発生します。TIRFMは、エバネッセント波を用いてサンプルの薄いスライスを蛍光発光させるため、バックグラウンドノイズとアーティファクトは本質的に少なくなります。しかし、ポアソンノイズ、光学収差、光退色、その他の蛍光分子など、他のノイズやアーティファクトは依然として存在します。

ポアソンノイズは光測定における基本的な不確実性です。これは蛍光光子の検出時に不確実性を引き起こします。^[18]ある測定でN個の光子が測定された場合、真の平均値がN +√NからN −√Nの範囲にある確率は63%です。^[19]このノイズは、誤ったピクセル位置で物体の誤認識を引き起こす可能性があります。

光学収差は、蛍光の回折や顕微鏡と対物レンズのずれによって発生する可能性があります。試料スライド上での光の回折は蛍光信号を拡散させ、畳み込み画像にぼやけを引き起こす可能性があります。同様に、対物レンズ、フィルター、検出器の間にずれがあると、励起光または蛍光光の焦点が合わず、画像にぼやけが生じる可能性があります。^[14]

光退色は、蛍光体中の共有結合または非共有結合が励起光によって破壊され、蛍光を発せなくなることで発生します。 ^[20]蛍光物質は励起光のエネルギーによって必ずある程度劣化し、蛍光が弱まり、暗くぼやけた画像になります。^[21]光退色は避けられませんが、不要な光への曝露を避け、光散乱を最小限に抑える浸漬油を使用することで最小限に抑えることができます。^[13]

自己蛍光は、特定の細胞構造において、その構造に含まれる天然化合物が比較的短い波長（励起波長に近い波長）で励起されると蛍光を発する現象で発生することがあります。^[18]また、誘導蛍光は、特定の非自己蛍光化合物が特定の化学物質（ホルムアルデヒドなど）と結合して蛍光を発するようになる場合にも発生します。^[13]これらの蛍光は、画像にアーティファクトや背景ノイズをもたらす可能性があります。他の蛍光化合物によるノイズは、フィルターを用いて目的の蛍光波長を捕捉するか、サンプル中に自己蛍光化合物が存在しないようにすることで効果的に除去できます。

現在および将来の仕事

現代の蛍光技術では、ぼやけやノイズを除去する手法が取り入れられています。光学収差は一般的に決定論的です（画像処理全体を通して、また異なるサンプル間でも一定です）。^{[18]決定論的なぼやけは、信号を}逆畳み込みし、既知のアーティファクトを差し引くことで除去できます。逆畳み込み技術とは、逆フーリエ変換を用いて元の蛍光信号を取得し、アーティファクトを除去するだけの単純な手法です。^[19]

しかしながら、デコンボリューションは強い蛍光信号がある場合、またはノイズが明確に識別されている場合にのみ有効であることが示されています。さらに、デコンボリューションは統計情報を含まないため、ポアソンノイズなどの非決定論的ノイズを低減できないため、性能が不十分です。より良い画像解像度と画質を得るために、研究者は統計的手法を用いて、光子が検出器上で分布する確率をモデル化してきました。^{[18] [22]}この手法は最大尤度法と呼ばれ、アルゴリズムによってさらに改良され、処理速度が向上しています。^[22]

参考文献

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外部リンク

• インタラクティブな蛍光染料とフィルターのデータベース Carl Zeiss のインタラクティブな蛍光染料とフィルターのデータベース。
• TIRF顕微鏡法：概要と応用Microscopy UのTIRFチュートリアル
• TIRF顕微鏡法：オリンパス顕微鏡リソースセンターによるTIRFの概要チュートリアル
• オリンパスTIRFM顕微鏡商用TIRF顕微鏡システム
• カールツァイスレーザーTIRF 3商用TIRF顕微鏡システム
• ライトガイドおよびプリズムベースのTIRF顕微鏡TIRF-Labs.com :商用TIRF顕微鏡および分光法。アプリケーションに合わせたTIRFMジオメトリの選択
• TIRF FLIM 顕微鏡Lambert Instruments TIRF - FLIM 顕微鏡
• シュワルツ研究グループ、コロラド大学ボルダー校単一分子イメージング研究グループ