牽引力顕微鏡
細胞表面を分子レベルで調べる方法

細胞生物学において、牽引力顕微鏡法（TFM ）は、 in vitro細胞外マトリックス（ECM） 内の周囲の変位場の測定値を取得することにより、細胞表面の牽引力を決定する実験方法です。

概要

細胞-ECMおよび細胞間相互作用の動的機械的挙動は、壊死、分化、接着、遊走、運動、成長など、広範囲の細胞機能に影響を及ぼすことが知られています。TFMは、実験的に観察されたECMの変位を利用して、細胞表面の牽引力、つまり応力ベクトルを計算します。TFM以前は、細胞の周りのシワが寄るシリコンゴム基質上の細胞牽引力を観察する取り組みがありましたが、 [1]このような技術では、シワの非線形で予測不可能な挙動のため、牽引力を正確に定量化することは困難です。数年後、TFMという用語は、基質の変形の測定値を推定牽引応力に変換するために作成された、より高度な計算手順を説明するために導入されました。[2]

一般的な方法論

従来の TFM では、細胞培養は、蛍光ミクロスフェア (通常は直径 0.2～1  μmのラテックスビーズ)が埋め込まれた光学的に透明な3D ECM上または内部に播種されます。 [3] [4] [5] [6] [7]この目的には、材料の機械的挙動が十分に特徴付けられ、ハイドロゲルが細胞の生存を維持できることを前提として、さまざまな天然および合成ハイドロゲルを使用できます。細胞はこの基質に独自の力を加え、その結果、ビーズが周囲の ECM 内に移動します。一部の研究では、界面活性剤、酵素、または薬剤を使用して細胞骨格を乱し、それによって細胞によって生成された牽引力を変更したり、場合によっては完全に排除したりします。

まず、一対の画像から連続的な変位場を計算します。最初の画像は孤立した細胞を囲むマイクロスフィアの基準構成であり、2 番目の画像は、細胞が生成した牽引力によって変位したマイクロスフィアに囲まれた同じ孤立した細胞です。細胞表面と蛍光ビーズの画像化には、通常、共焦点蛍光顕微鏡が使用されます。変形した構成と変形していない構成間の並進変位場を計算した後、多くの場合は正則化アプローチを使用してひずみ場を計算できます。その中で最も優れたのは弾性ネット正則化です。[8]ひずみ場から、周囲のハイドロゲル材料の応力 - ひずみ挙動、つまり構成モデルに関する知識を使用して、細胞を囲む応力場を計算できます。細胞表面への法線ベクトルを 3D 画像スタックから取得できる場合は、さらに一歩進んで、応力場を使用して細胞表面の牽引力を計算することができます。この手順は、マイクロスフィアの変位から細胞牽引力を得るための一般的な方法ですが、いくつかの研究では、逆計算アルゴリズムを利用して牽引力場を得ることに成功しています。[9] [10] [11]

制限事項

TFMで復元できるトラクションフィールドの空間分解能は、面積あたりの変位測定回数によって制限されます。[12]独立した変位測定間隔は実験設定によって異なりますが、通常は1マイクロメートル程度です。細胞が生成するトラクションパターンには、より小さな局所的な最大値と最小値が含まれることがよくあります。TFMを用いて局所的な細胞トラクションにおけるこのような微細な変化を検出することは、依然として困難です。

進歩

2D TFMでは、細胞は調整可能な剛性を持つ薄い基質の表面上に単層として培養され、基質表面付近のマイクロスフィアは細胞-ECM結合によって変形します。2.5D細胞培養も同様にECMの薄い層上で行われ、希釈された構造ECMタンパク質が細胞と基質の上に添加された培地に混合されます。TFMにおける初期の研究のほとんどは2Dまたは2.5Dで行われましたが、多くの細胞種は、 in vitro環境において真に生理学的に現実的な挙動を示すために、3D ECMからの複雑な生物物理学的および生化学的シグナルを必要とします。[13]

サブボリュームの回転や伸張が大きい場合、ほとんどのTFM技術は線形弾性に基づく計算フレームワークを採用しているため、細胞表面の張力の計算に誤差が生じる可能性があります。TFMの最近の進歩により、細胞は最大40%のひずみ量で変形できることが示されており、大きなひずみ量を考慮するには有限変形理論アプローチを用いる必要があります。[14]

アプリケーション

TFMは空間的に孤立した個々の細胞の表面における牽引力を観察するためによく用いられますが、TFMのバリエーションは多細胞システムの集団的挙動を解析するためにも用いられます。例えば、単層細胞シートの計算された応力変動マップと並行して、細胞の移動速度やプリソタキシスを観察する手法は、単層応力顕微鏡法と呼ばれます。 [15]単一細胞と合流した細胞層の機械的挙動は、単層では「綱引き」状態を経験するという点で異なります。また、細胞極性や移動の変化よりも早く牽引力の再分配が起こる可能性を示す証拠もあります。[16]

TFM は、硬膜外運動の研究にも特に有用であることが証明されています。

TFMは最近、大きな牽引力を生み出す細胞は、牽引力の低い細胞よりも浸潤性が高いという仮説に基づき、癌細胞の浸潤メカニズムの探究に応用されている。 [17]また、TFMの最近の知見は、末梢神経系[18]、動脈移植[19]、および上皮皮膚細胞[20]の組織工学および再生のための最適な足場の設計に貢献することが期待されている。

参考文献

  1. ^ AK Harris, P Wild, D Stopak. シリコーンゴム基質：細胞運動研究における新たな展開Science 208(4440):177–179, 1980.
  2. ^ Munevar, S; Wang, Y; Dembo, M (2001). 「遊走中の正常線維芽細胞およびh-ras変異導入3t3線維芽細胞の牽引力顕微鏡観察」. Biophysical Journal . 80 (4): 1744– 1757. Bibcode :2001BpJ....80.1744M. doi :10.1016/s0006-3495(01)76145-0. PMC  1301364. PMID  11259288 .
  3. ^ Maskarinec, SA; Franck, C; Tirrell, DA; Ravichandran, G (2009). 「3次元における細胞牽引力の定量化」. Proceedings of the National Academy of Sciences . 106 (52): 22108– 22113. Bibcode :2009PNAS..10622108M. doi : 10.1073/pnas.0904565106 . PMC 2799761. PMID  20018765 . 
  4. ^ Franck, C; Hong, S; Maskarinec, SA; Tirrell, DA; Ravichandran, G (2007). 「共焦点顕微鏡とデジタル体積相関法を用いた軟質材料の大変形の3次元全視野測定」.実験力学. 47 (3): 427– 438. doi :10.1007/s11340-007-9037-9. S2CID  137243239.
  5. ^ TM Koch, S Munster, N Bonakdar, JP Butler, B Fabry. 癌細胞浸潤における3D牽引力PLoS ONE 7(3):e33476, 2012
  6. ^ Legant, WR; Choi, CK; Miller, JS; Shao, L; Gao, L; Betzig, E; Chen, CS (2013). 「多次元牽引力顕微鏡法による焦点接着面の面外回転モーメントの解明」. Proceedings of the National Academy of Sciences . 110 (3): 881– 886. Bibcode :2013PNAS..110..881L. doi : 10.1073/pnas.1207997110 . PMC 3549134. PMID  23277584 . 
  7. ^ 「牽引力顕微鏡法」cellmechanics.de .
  8. ^ Huang, Yunfei.; et al. (2019). 「細胞比較のための最適化された正規化と自動ベイズパラメータ選択を備えた牽引力顕微鏡法」. Scientific Reports . 9 (1): 537. arXiv : 1810.05848 . Bibcode :2019NatSR...9..539H. doi : 10.1038/s41598-018-36896-x . PMC 6345967. PMID  30679578 . 
  9. ^ M DemboとY Wang. 1999 線維芽細胞の運動中の細胞と基質の界面における応力. 生物物理学ジャーナル, 76(4):2307–2316.
  10. ^ Legant, WR; Miller, JS; Blakely, BL; Cohen, DM; Genin, GM; Chen, CS (2010). 「三次元マトリックス中の細胞が及ぼす機械的牽引力の測定」. Nature Methods . 7 (12): 969– 971. doi :10.1038/nmeth.1531. PMC 3056435. PMID 21076420  . 
  11. ^ Dong, Li; Oberai, Assad A. (2017-02-01). 「3次元非線形超弾性マトリックスにおける細胞牽引力の回復」.応用力学・工学におけるコンピュータ手法. William S. Klugに捧ぐ生物システム特集号. 314 : 296–313 . Bibcode :2017CMAME.314..296D. doi : 10.1016/j.cma.2016.05.020 .
  12. ^ Sabass, B; Gardel, ML; Waterman, CM; Schwarz, US (2008). 「実験と計算の進歩に基づく高解像度牽引力顕微鏡法」. Biophysical Journal . 94 (1): 207– 220. Bibcode :2008BpJ....94..207S. doi :10.1529/biophysj.107.113670. PMC 2134850. PMID  17827246 . 
  13. ^ LGグリフィスとMAシュワルツ. 複雑な3D組織生理をin vitroで捉える. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 7(3):211–224, 2006
  14. ^ Toyjanova, J; Bar-Kochba, E; Lopez-Fagundo, C; Reichner, J; Hoffman-Kim, D; Franck, C (2014). 「高解像度、大変形3Dトラクションフォース顕微鏡法」. PLOS ONE . 9 (4) e90976. Bibcode :2014PLoSO...990976T. doi : 10.1371/journal.pone.0090976 . PMC 3989172. PMID  24740435 . 
  15. ^ Tambe, Dhananjay T., et al. 「協調的な細胞間力による集団細胞誘導」 Nature Materials 10.6 (2011): 469-475.
  16. ^ ムネバー、スティーブン、ユリ・ワン、ミカ・デンボ。「遊走中の正常線維芽細胞およびH-ras変異3T3線維芽細胞の牽引力顕微鏡観察」生物物理学ジャーナル80.4（2001）：1744-1757。
  17. ^ Koch, Thorsten M.; et al. (2012). 「癌細胞浸潤における3D牽引力」. PLOS ONE . 7 (3) e33476. Bibcode :2012PLoSO...733476K. doi : 10.1371/journal.pone.0033476 . PMC 3316584. PMID  22479403 . 
  18. ^ López-Fagundo, Cristina; et al. (2014). 「コンプライアント基質上のシュワン細胞の3次元牽引力」Journal of the Royal Society Interface . 11 (97) 20140247. doi : 10.1098/rsif.2014.0247 . PMC 4208357 . PMID  24872498. 
  19. ^ George, JC, et al. 「血管平滑筋細胞の収縮力は形状に依存する」Integrative Biology 6.2 (2014): 152-163.
  20. ^ Vedula、Sri Ram Krishna他「上皮橋は集団細胞移動中に組織の完全性を維持する」Nature Materials (2013)。
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