ねじれたインターカレーション核酸

ねじれインターカレーティング核酸（TINA）は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）に添加されると、二本鎖DNA（dsDNA）およびTFOからのフーグスティーン三重鎖DNA形成を安定化させる核酸分子である。 ^[1]三重結合をねじるその能力により、三重鎖DNAを形成するために二本鎖DNA内でのインターカレーションが容易になる。特定の構成は、ワトソン・クリック反平行二本鎖DNAを安定化させることが分かっている。TINA-DNAプライマーは、PCRにおける結合の特異性を高めることが分かっている。グアニン四重鎖へのTINA挿入の使用は、抗HIV-1活性を増強させることも分かっている。TINA安定化PTは、DNAベースの臨床診断アッセイの感度と特異性を向上させる。

三本鎖DNA

三重らせん構造は、一本鎖三重らせん形成オリゴヌクレオチド（TFO）が、特定の主溝相互作用を介してプリン含有dsDNA鎖に結合することで形成される。^[2]一般的に、TFOの第三鎖親和性は低い。これは、生理的条件下では、平行（ピリミジン）結合モチーフにおいてpH感受性のC+-G-Cフーグスティーン塩基三重らせん構造を形成する必要があるためである。TFOの改変は、標的への結合親和性を向上させ、新たな三重らせん核酸塩基の設計によってdsDNA配列の制約を軽減するために試みられてきた。最近、ホモピリミジンオリゴデオキシヌクレオチドの中央に (R)-1-O-[4-(1-ピレニルエチニル)フェニルメチル]グリセロール (TINA) をバルジ挿入すると、フーグスティーン型三本鎖および二本鎖の熱安定性が向上する一方で、同じヌクレオチド含有量のワトソン・クリック型二本鎖は不安定になることがわかった。^[3] ∆Tm を増加させるには、塩基ミスマッチを TFO の中央に配置する必要があり、可能であれば A、C、または T から G の塩基ミスマッチは避けるべきである。塩基ミスマッチは、塩基ミスマッチの両側に TINA を挿入することで中和でき、塩基ミスマッチの3' または5'に直接挿入する TINA によってマスクすることができる。

アプリケーション

アッセイ特異性

DNAハイブリダイゼーションを用いた診断アッセイは、反平行二本鎖ヘリックスの解離によって制限されます。この制限は、オルト-TINAのようなインターカレーターなどのDNA安定化分子を用いることで改善できます。インターカレーターは二本鎖形成を安定化します。研究によると、3'末端と5'末端にインターカレーションプライマーを用いた場合、安定性が最大限に向上することが示されています。オリゴヌクレオチドにTINA分子を配置することで、プローブハイブリダイゼーションの分析感度を向上させることができます。パラ-TINA分子は、特にオリゴヌクレオチドの中央に位置する場合、あらゆる位置でTmを低下させます。一方、オルト-TINA分子では、中央が中和されている場所であればどこでもTmの向上が見られました。末端のパラ-またはオルト-分子と内部のTINA分子の組み合わせは、Tmの上昇が最も顕著でした。Tmを最大限まで上昇させるには、TINA分子を末端に配置する必要があります。Tmの上昇は、PCRなどのアッセイの特異性を高めます。^[4]

抗HIV-1活性

最近の研究では、グアニン四重鎖へのTINA挿入も抗HIV-1活性を高めることが示されています。これらの研究では、細胞株に対して抗HIV-1活性を示す2つのグアニン四重鎖形成配列を、ロックド核酸（LNA）またはTINA挿入を用いて改変しました。これにより、抗HIV-1活性が最大8倍向上し、5'リン酸の導入によりグアニン四重鎖の二量体化が阻害されることが示されました。多くの抗ウイルス四重鎖形成オリゴヌクレオチドは、より熱的に安定したグアニン四重鎖と高次グアニン四重鎖構造を形成し、これが観察された抗ウイルス活性に寄与している可能性があります。^[5]

治療への応用

TFOは高い配列特異性を有するため、抗遺伝子療法への応用が期待されています。しかしながら、生体内のカリウム濃度はTFOが単独でGカルテット構造を形成することを促進し、TFOSが三重鎖形成で相互作用することを阻害し、TFO細胞療法の効果を低下させます。しかし、Paramasivamらが示したように、高グアニン濃度のTFOに(R)-1-O-[4-(1-ピレニルエチニル)フェニルメチル]グリセロール(TINA)をバルジ挿入することで、カリウムを介した自己会合の存在が大幅に減少します。したがって、TINA-TFOは将来、生体内でゲノムを標的とし、治療目的のゲノム操作を行うために使用される可能性があります。プリンTINA-TFOの使用は、KRASプロトオンコゲンに対する抗原分子として特に有望です。^[6]

参考文献

1. Géci, Imrich; Filichev, Vyacheslav V.; Pedersen, Erik B. (2007-07-27). 「マイクロ波加速クリックケミストリー法を用いて調製した、1,2,3-トリアゾール基を組み込んだねじれインターカレーション核酸（TINA）による平行三本鎖の安定化」. Chemistry - A European Journal . 13 (22): 6379– 6386. doi :10.1002/chem.200700053. ISSN  0947-6539. PMID  17503418.
2. Géci, Imrich; Filichev, Vyacheslav V; Pedersen, Erik B (2006). 「アクリジン誘導体を有するねじれインターカレーション核酸の合成．熱安定性研究」.バイオコンジュゲート化学. 17 (4): 950– 957. doi :10.1021/bc060058o. PMID  16848402.
3. Filichev, Vyacheslav V; Pedersen, Erik B (2005). 「合成後Sonogashira固相カップリング反応により調製したねじれインターカレーション核酸（TINA）を用いたHoogsteen型三本鎖および二本鎖の安定かつ選択的な形成」アメリカ化学会誌. 127 (42): 14849– 14858. doi :10.1021/ja053645d. PMID  16231939.
4. Filichev, Vyacheslav V; Astakhova, Irina V; Malakhov, Andrei D; Korshun, Vladimir A; Pedersen, Erik B (2008). 「ねじれインターカレーション核酸の構造における1-, 2-, 4-エチニルピレン：構造、熱安定性、および蛍光特性の関係」. Chemistry - A European Journal . 14 (32): 9968– 9980. doi :10.1002/chem.200800380. PMID  18810743.
5. Pedersen, Erik B; Nielsen, Jakob T; Nielsen, Claus; Filichev, Vyacheslav V (2011). 「ロックド核酸とインターカレーティング核酸を含むグアニン四重鎖の抗HIV-1活性の増強」Nucleic Acids Research . 39 (6): 2470– 2481. doi :10.1093/nar/gkq1133. PMC 3064782 . PMID  21062811. 
6. Paramasivam, Manikandan; Cogoi, Susanna; Filichev, Vyacheslav V; Bomholt, Niels; Pedersen, Erik B; Xodo, Luigi E (2008). 「プリンツイストインターカレーション核酸：カリウム誘導凝集に耐性のある新たな抗遺伝子分子群」. Nucleic Acids Research . 36 (10): 3494– 3507. doi :10.1093/nar/gkn242. PMC 2425464. PMID 18456705  .