二次元クロマトグラフィー
2016年、ポーランド、グダニスクGUT化学学部における二次元クロマトグラフGCxGC-TOFMS

二次元クロマトグラフィーは、注入されたサンプルを2つの異なる分離段階に通すことで分離するクロマトグラフィー技術の一種です。2つの異なるクロマトグラフィーカラムが順番に接続され、最初のシステムからの溶出液が2番目のカラムに移されます。 [1]通常、2番目のカラムは異なる分離機構を持つため、1番目のカラムで分離が不十分なバンドも2番目のカラムで完全に分離されます。（例えば、C18逆相クロマトグラフィーカラムの後にフェニルカラムが続く場合があります。）あるいは、2つのカラムが異なる温度で動作する場合があります。分離の2番目の段階では、検出器がまだ1つしかないため、分離速度は1番目の段階よりも速くなければなりません。平面表面は、2つの異なる溶媒を用いて2方向への連続展開に適しています。

歴史

現代の二次元クロマトグラフィー技術は、液体移動相と固体固定相を用いたペーパークロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィー（TLC）の初期の開発成果に基づいています。これらの技術は、後に現代のガスクロマトグラフィー（GC）と液体クロマトグラフィー（LC）分析を生み出しました。一次元GCとLCの様々な組み合わせにより、二次元クロマトグラフィーとして知られる分析クロマトグラフィー技術が生まれました。

2Dクロマトグラフィーの最も初期の形態は、多段階TLC分離法でした。この分離法では、まずセルロースの薄いシートをある溶媒で一方向に流し、その後、シートを乾燥させた後、別の溶媒を最初の溶媒とは直角の方向に流します。この手法は、1944年にAJP Martinらがアミノ酸を効率的に分離する方法を詳述した論文で初めて文献に登場しました。「…しかし、2次元クロマトグラムは特に便利で、通常は多数の実験の結果としてしか得られない情報を一目で確認できます」（Biochem J., 1944, 38, 224）。

例

二次元分離はガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーで行うことができます。第一カラムから第二カラムへ「再サンプリング」するための様々なカップリング戦略が開発されています。二次元分離に重要なハードウェアとしては、第一次元の溶離液を第二次元カラムへ選択的に移動させるディーンスイッチとモジュレーターがあります。[2]

2次元分離法の主な利点は、どちらのカラムでも極めて効率的な分離を必要とせずに、ピーク容量を大幅に増加できることです。（例えば、第1カラムのピーク容量（k 1）が10分間の分離で100で、第2カラムのピーク容量（k 2）が5秒間の分離で5の場合、合計ピーク容量はk 1 × k 2 =500に近づく可能性がありますが、全体の分離時間は依然として約10分です）。2次元分離は、ガソリンなどの石油混合物の分析に適用されており、最近ではタンパク質混合物にも適用されています。[3] [4]

タンデム質量分析法

三連四重極（QQQ）質量分析計の図

タンデム質量分析法（タンデムMSまたはMS/MS）は、2台の質量分析計を連続して使用し、より複雑な分析対象物の混合物を分離します。タンデムMSの利点は、他の2次元分析法よりもはるかに高速で、分析時間は数ミリ秒から数秒の範囲であることです。[5] MSでは溶媒による希釈がないため、干渉の可能性が低く、タンデムMSは他の2次元分析法と比較して感度が高く、信号対雑音比が高くなります。タンデムMSの主な欠点は、必要な機器が高額なことです。価格は50万ドルから100万ドル以上に及びます。[6]多くの形式のタンデムMSには、質量選択ステップとフラグメンテーションステップが含まれます。最初の質量分析計は、特定の質量電荷比の分子のみを通過させるようにプログラムできます。次に、2番目の質量分析計で分子をフラグメント化し、その同一性を特定します。これは、同じ質量の分子（つまり、同じ質量のタンパク質または分子異性体）を分離する場合に特に有用です。異なるタイプの質量分析計を組み合わせることで、様々な効果を得ることができます。一例として、TOF-四重極システムが挙げられます。イオンはTOFからm/zの昇順に放出され、四重極で順次フラグメント化および／または分析されます。もう一つの一般的なタンデム質量分析計は、四重極-四重極-四重極（QQQ）分析計です。最初の四重極で質量分離を行い、2番目の四重極で衝突が起こり、3番目の四重極でフラグメントが質量分離されます。

四重極型/飛行時間型質量分析器の図。イオン化されたソースサンプルはまず四重極型質量分析器に入り、次に飛行時間型質量分析器に入ります。

ガスクロマトグラフィー質量分析法

GCMSの図。この図は分析対象物質の経路を示しています。分析対象物質はまずガスクロマトグラフを通過し、分離された分析対象物質は質量分析にかけられます。MSでは、ToF型、四重極型など、様々なタイプの質量分析計を使用できます。[5]

ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）は、ガスクロマトグラフィーの分離技術と質量分析の同定技術を組み合わせた二次元クロマトグラフィー技術です。GC-MSは、複雑な混合物中の揮発性および半揮発性有機化合物の分析において最も重要な分析ツールです。[7]まずサンプルをGCの注入口に注入し、そこでサンプルは気化され、キャリアガス（通常はヘリウム）によってカラムに押し出されます。サンプル中の分析対象物質は、カラムのコーティング（固定相）およびキャリアガス（移動相）との相互作用に基づいて分離されます。[8]カラムから溶出された化合物は、質量分析装置を通過する前に、電子衝撃（EI）または化学イオン化（CI）によってイオンに変換されます。 [9]質量分析装置は、質量と電荷に基づいてイオンを分離する役割を果たします。よく使用されるGC-MSは、同じ機能を果たしますが、分離の方法が異なります。[10] GC-MSで一般的に使用される分析装置は、飛行時間型質量分析装置と四重極型質量分析装置である。[8]質量分析装置を通過した分析対象物質は検出器に到達し、そこで信号を発生する。この信号はコンピュータによって読み取られ、ガスクロマトグラムと質量スペクトルの作成に用いられる。GC-MSでは、特に複雑なサンプルでは2台のガスクロマトグラファーを用いて高い分離能を得ることがあり、GCxGC-(MS)と呼ばれる手法で特定の種を適切なピークに明確に割り当てることができる。[11]結局のところ、GC-MSは多くの分析研究室で利用されている手法であり、非常に効果的で適応性の高い分析ツールである。

液体クロマトグラフィー質量分析法

液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）は、高分解能クロマトグラフィー分離とMS検出を組み合わせたものです。このシステムはHPLCの高い分離能を採用しているため、液体移動相中の分析対象物質は、大気圧化学イオン化（APCI）、エレクトロスプレーイオン化（ESI）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）といった様々なソフトイオン化法によってイオン化されます。これらのソフトイオン化法は、MSとの結合に必要な気相イオン化を実現します。[要出典]これらのイオン化法は、GC-MSでは通常は分析できない、質量の大きい化合物、熱的に不安定な化合物、または不揮発性化合物など、より広範な生体分子の分析を可能にします。

LC-MSは、特定の質量を選択することで未分離ピークを分離できるため、高い選択性を提供します。さらに、質量スペクトルによってより正確な同定が可能になり、分析対象物の保持時間だけに頼る必要がなくなります。その結果、LC-MSでは分子量や構造情報だけでなく、定量データも得ることができます。[9] LCは不純物の効率的な分離を可能にし、MSは不純物プロファイリングのための構造特性評価を可能にするため、LC-MSは医薬品開発や医薬品製造における不純物の同定やプロファイリングなど、様々な分野に応用できます。[12]

LCMSの図。サンプルはまずHPLCで分析され、次に質量分析されます。MSでは、ToF、四重極など、様々なタイプの質量分析装置を使用できます。[5]

水、アセトニトリル、メタノールなど、通常相または逆相LCで使用される一般的な溶媒はすべてESIに適合しますが、LCグレードの溶媒はMSには適さない場合があります。さらに、無機イオンを含む緩衝液はイオン源を汚染する可能性があるため、使用を避ける必要があります。[13]しかし、この問題は2D LC-MSによって解決でき、分析対象物質の共溶出やUV検出応答など、その他の様々な問題も解決できます。[14]

液体クロマトグラフィー-液体クロマトグラフィー

二次元液体クロマトグラフィー（2D-LC）は、液体クロマトグラフィーの2つの独立した分析を1つのデータ分析に統合します。現代の2D液体クロマトグラフィーは、1970年代後半から1980年代初頭にかけて発展しました。この間、2D-LCの仮説的な原理は、実験や補足的な概念的・理論的研究を通じて実証され、2D-LCは従来の一次元液体クロマトグラフィーに比べてはるかに高い分解能を提供できることが示されました。1990年代には、2D-LC技術は、プロテオミクスやポリマー研究分野における極めて複雑な物質や材料の分離において重要な役割を果たしました。しかし残念ながら、この技術は分析時間に関して重大な欠点があることが判明しました。初期の2D-LC研究は、機器の分析時間が長かったため、液相分離のごく一部に限られていました。現代の2D-LC技術はこの欠点に真正面から取り組み、かつては欠点であった特性を大幅に低減しました。現代の2D-LCは、1時間以内に高分解能分離を完了できる装置能力を備えています。ますます複雑化する物質をより優れた検出限界で分析するための装置に対する需要の高まりにより、2D-LCの開発は加速しています。装置部品は産業界の主流となり、以前よりもはるかに入手しやすくなりました。それ以前は、2D-LCは1D-LC装置の部品を使用して行われ、精度と精密度の両方において結果にばらつきがありました。装置エンジニアリングへの負担が軽減されたことで、2D-LCの分野と技術における先駆的な研究が可能になりました。

この技術を用いる目的は、一次元液体クロマトグラフィーでは効果的に分離できない混合物を分離することです。二次元液体クロマトグラフィーは、尿、環境物質、血液などの法医学的証拠など、複雑な混合物サンプルの分析に適しています。

混合物の分離の難しさは、混合物の複雑さに起因すると考えられる。つまり、化合物に含まれる異なる溶出物の数が多いため分離が不可能である。一次元液体クロマトグラフィーに関連するもう一つの問題は、密接に関連する化合物の分離の難しさである。密接に関連する化合物は類似した化学的性質を持ち、極性、電荷などに基づいて分離することが困難な場合がある。[15]二次元液体クロマトグラフィーは、複数の化学的または物理的性質に基づく分離を提供する。NagyとVekeyの例を用いると、ペプチドの混合物は塩基性に基づいて分離できるが、類似したペプチドはうまく溶出しない可能性がある。その後にLC技術を使用することで、ペプチド間の類似した塩基性は、非極性特性の違いを利用することでさらに分離することができる。[16]

その結果、混合物をより効率的に分離するためには、後続のLC分析では最初のカラムとは大きく異なる分離選択性を採用する必要があります。BusheyとJorgensonによると、2D液体クロマトグラフィーを効果的に使用するためのもう一つの要件は、高度に直交した技術を採用することであり、つまり2つの分離技術は可能な限り異なるものでなければならないということです。[17]

1次元LCの図。この手法によるスペクトル結果の例も示されている。[15]
2次元LCの図。この特定の技術によるスペクトル結果の例も示されている。[15]

2D液体クロマトグラフィーには、大きく分けて2つの分類があります。包括的2D液体クロマトグラフィー（LCxLC）とハートカット2D液体クロマトグラフィー（LC-LC）です。[18]包括的2D-LCでは、カラム溶出液からのすべてのピークが完全にサンプリングされますが、サンプル全体を1次元目から2次元目に移す必要はないと考えられています。サンプルの一部は廃棄され、残りはサンプリングバルブに送られます。ハートカット2D-LCでは、特定のピークをターゲットとし、ピークのごく一部のみが2次元目のカラムに注入されます。ハートカット2D-LCは、保持挙動が類似している限り、それほど複雑ではない物質のサンプル分析に非常に有効であることが証明されています。包括的2D-LCと比較して、ハートカット2D-LCは、システムセットアップがはるかに少なく、運用コストもはるかに低い効果的な手法です。マルチハートカット（mLC-LC）は、2次元目分析の一時的な重複をリスクにさらすことなく、1次元目分析から複数​​のピークをサンプリングするために利用できます。[18]マルチハートカット（mLC-LC）は、複数のサンプリングループのセットアップを利用します。

2D-LCにおいて、ピークキャパシティは非常に重要な問題です。これは、十分な時間があれば、グラジエント溶出分離を用いることで、アイソクラティック分離よりもはるかに高い効率で生成できます。アイソクラティック溶出は短時間での処理がはるかに容易ですが、2次元目ではグラジエント溶出分離を行うことが好ましいです。移動相の強度は、弱い溶出液組成から強い溶出液組成まで変化させます。逆相クロマトグラフィーにおけるグラジエント溶出の線形溶媒強度理論（LSST）に基づき、保持時間、機器変数、および溶質パラメータの関係を以下に示します。[18]

t R =t 0 +t D + t 0 /b*ln(b*(k 0 -t d /t 0 ) + 1)

2D-LCが主要な分析クロマトグラフィー技術となって以来、多くの先駆的な研究が行われてきましたが、依然として考慮すべき現代的な課題が数多く残されています。多くの実験変数が未だ決定されておらず、この技術は常に発展途上にあります。

ガスクロマトグラフィー – ガスクロマトグラフィー

包括的二次元ガスクロマトグラフィーは、複雑な混合物を分離・分析する分析技術です。香料、香料、環境研究、医薬品、石油製品、法医学などの分野で利用されています。GCxGCは、幅広い感度範囲を提供し、ピークキャパシティの向上により優れた分離能を実現します。

参照

参考文献

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