シングルドメイン抗体
Antibody fragment
ラマのV H Hドメインのリボン図。
延長されたCDR3ループはオレンジ色で示されています。

単一ドメイン抗体（sdAb ）はナノボディとも呼ばれ、単一のモノマー可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。抗体全体と同様に、特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか12～15 kDaの単一ドメイン抗体（sdAb）は、2つの重タンパク質鎖と2つの軽鎖からなる一般的な抗体（150～160 kDa）よりもはるかに小さく、Fabフラグメント（約50 kDa、1つの軽鎖と半分の重鎖）や単一鎖可変フラグメント（約25 kDa、2つの可変ドメイン、1つは軽鎖から、もう1つは重鎖から）よりもさらに小さい。[1]

最初のシングルドメイン抗体は、ブリュッセル自由大学でラクダ科動物から発見された重鎖抗体から作製されました。これらはV ​​H Hフラグメントと呼ばれています。軟骨魚類も重鎖抗体（IgNAR、「免疫グロブリン新抗原受容体」）を有しており、そこからV NARフラグメントと呼ばれるシングルドメイン抗体が得られます。[2]別のアプローチとして、ヒトまたはマウスに共通する免疫グロブリンG （IgG）の二量体可変ドメインを単量体に分割する方法があります。現在、シングルドメイン抗体の研究のほとんどは重鎖可変ドメインに基づいていますが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。[3]

ラクダ科動物のナノボディは抗体と同等の特異性を示し、場合によってはより堅牢性があることが示されています。抗体と同じファージパンニング法を用いて容易に単離できるため、高濃度でin vitro培養が可能です。サイズが小さくドメインが単一であるため、これらの抗体は細菌細胞への形質転換が容易で、大量生産が可能であり、研究目的に最適です。[4]

シングルドメイン抗体は、複数の医薬品への応用について研究されており、急性冠症候群、癌、アルツハイマー病[5] [6]、COVID-19 [7] [8] [9]の治療に使用できる可能性があります。

プロパティ

シングルドメイン抗体は、約 110 個のアミノ酸からなるペプチド鎖で、重鎖抗体または一般的な IgG の 1 つの可変ドメイン (V H ) で構成されています。これらのペプチドは、全抗体と同様の抗原親和性がありますが、耐熱性が高く、洗剤や高濃度の尿素に対して安定しています。ラクダ科動物や魚類の抗体に由来するものは、通常軽鎖に結合する親油性部位を覆う拡張ループ (上記のリボンの図でオレンジ色) を形成する相補性決定領域 3 (CDR3)により、親油性が低く、水への溶解性が高くなっています。[10] [11]一般的な抗体とは対照的に、1999 年の研究では、6 つのシングルドメイン抗体のうち 2 つが 90 °C (194 °F) の温度に耐え、抗原に結合する能力を失いませんでした。[12]胃酸とプロテアーゼに対する安定性は、アミノ酸配列によって異なります。いくつかの種は経口投与後に腸内で活性を示すことが示されているが[13] [14] 、腸からの吸収が低いため、経口投与された全身活性の単一ドメイン抗体の開発が妨げられている。

単一ドメイン抗体とタンパク質抗原の複合体は、埋もれた結合部位を明らかにする。[15]（左）コモリザメV NAR単一ドメインとリゾチーム（PDB 1T6V）の複合体。（右）ヒト化HyHEL-10 Fvとリゾチーム（PDB 2EIZ）の複合体。

比較的低い分子量は組織透過性を高め、腎排泄のため血漿半減期が短くなります。[1]完全抗体とは異なり、 Fc領域がないため補体系誘導性細胞毒性を示しません。ラクダ科動物や魚類由来のsdAbは、完全抗体ではアクセスできない隠れた抗原、例えば酵素の活性部位に結合することができます。[15]この特性は、そのような隠れた部位に浸透できる拡張CDR3ループに起因することが示されている。[11] [16] [15]

生産

サメ（左）とラクダ科（中央）の重鎖抗体と一般的な抗体（右）の比較。重鎖は濃い色で、軽鎖は薄い色で示されている。V HとV Lは可変ドメインである。

重鎖抗体から

単一ドメイン抗体は、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ、またはサメを目的の抗原で免疫し、続いて重鎖抗体の可変領域（V NARおよびV H H）をコードするmRNAを単離することによって得ることができる。大きなファージディスプレイV NARおよびV H H単一ドメインライブラリは、コモリザメ[17]およびヒトコブラクダ[ 9]から確立された。[ 18]ファージディスプレイやリボソームディスプレイなどのスクリーニング技術は、抗原に結合するクローンを同定するのに役立つ。[19] [17] [20] [9] [21] [8] [18] V NARを含む単一ドメイン抗体は、臨床応用のためにヒト化することができる。[22]

従来の抗体から

あるいは、シングルドメイン抗体は、4つの鎖を持つ一般的なマウス[23]、ウサギ[24]、またはヒトIgG [25]から作成できます。 [26]プロセスは同様で、免疫化されたまたは未処置のドナーからの遺伝子ライブラリーと、最も特異的な抗原を識別するためのディスプレイ技術で構成されます。 このアプローチの問題点は、一般的なIgGの結合領域が2つのドメイン（V HとV L）で構成されており、これらのドメインが親油性のために二量体化または凝集する傾向があることです。 モノマー化は通常、親油性アミノ酸を親水性アミノ酸に置き換えることによって達成されますが、抗原に対する親和性が失われることがよくあります。[27]親和性を維持できれば、シングルドメイン抗体は同様に大腸菌[24]、[25]、[28] 、 S. cerevisiaeなどの生物で生成できます。

ヒト単一ドメイン抗体から

ヒトは、軽鎖に終止コドンをランダムに生成することで、単一ドメイン抗体を産生することがあります。メソテリン[28] 、 GPC2 [29]、GPC3 [25] [30]など、様々な腫瘍抗原を標的とするヒト単一ドメイン抗体がファージディスプレイ法によって単離されました。HN3ヒト単一ドメイン抗体は、肝癌治療のための免疫毒素[30] [31] [32]やキメラ抗原受容体（CAR）T細胞[33]の作成に用いられています。HN3ヒト単一ドメイン抗体によってGPC3のWnt結合ドメインを阻害すると、肝癌細胞におけるWnt活性化が阻害されます[34] 。

潜在的な用途

シングルドメイン抗体は、その小型さ、製造の容易さ、高い親和性により、バイオテクノロジー分野だけでなく治療分野でも幅広い用途に応用できる。[35] [36] [15]

バイオテクノロジーおよび診断

蛍光タンパク質をナノボディに融合させることで、いわゆるクロモボディが生成されます。クロモボディは、生細胞の様々な区画における標的を認識・追跡するために使用できます。そのため、生細胞顕微鏡観察の可能性を高め、新たな機能研究を可能にします。[37]抗GFPナノボディをGFPナノトラップと呼ばれる一価マトリックスに結合させることで、GFP融合タンパク質とその相互作用パートナーを単離し、さらなる生化学分析を行うことができます。[38]超解像イメージング技術を用いた単一分子の局在化には、蛍光色素を標的タンパク質の近傍に特異的に送達する必要があります。蛍光色素はサイズが大きいため、有機色素に結合した抗体を使用すると、蛍光色素と標的タンパク質間の距離が離れているため、誤ったシグナルが生じる可能性があります。GFPタグ付きタンパク質を標的とする抗GFPナノボディに有機色素を融合させることで、ナノメートルレベルの空間分解能と、その小型で高い親和性による最小限のリンケージエラーが可能になります。[39]ナノボディのサイズ配当は、相関光電子顕微鏡研究にも有益です。透過処理剤を一切使用せずに、化学的に固定された細胞の細胞質は、蛍光標識ナノボディによって容易にアクセス可能です。また、ナノボディはサイズが小さいため、通常の抗体よりも体積サンプルの深部まで浸透することができます。蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で画像化された組織において、高い超微細構造品質が維持されます。これは、分子標識と電子顕微鏡画像の両方を必要とする神経科学研究に特に有用です。[40]

診断用バイオセンサー用途において、ナノボディは将来的にツールとして利用できる可能性があります。ナノボディはサイズが小さいため、バイオセンサー表面に高密度に結合できます。アクセスしにくいエピトープを標的とする利点に加え、ナノボディの立体構造安定性は、表面再生条件に対する高い耐性にもつながります。ヒト前立腺特異抗原（hPSA）を感知するセンサー表面に単一ドメイン抗体を固定化し、試験を行いました。その結果、ナノボディは臨床的に有意な濃度のhPSAを検出する際に、従来の抗体よりも優れた性能を示しました。[41]

標的分子の結晶化確率を高めるために、ナノボディは結晶化シャペロンとして用いることができる。補助タンパク質として、ナノボディは特定のコンフォメーション状態にのみ結合して安定化させることで、コンフォメーションの不均一性を低減することができる。また、結晶化を妨げる表面を覆い、結晶接触を形成する領域を拡大することもできる。[42] [36]

治療的

光熱療法用ナノボディ。HER2などの腫瘍抗原に結合できるナノボディは、光エネルギーを吸収して熱を発生させ、癌細胞を死滅させる分岐金ナノ粒子と結合しています。

シングルドメイン抗体は、複数の標的に対する新たな治療ツールとして試験されています。インフルエンザAウイルス亜型H5N1に感染したマウスにおいて、ヘマグルチニンを標的としたナノボディは、生体内でH5N1ウイルスの複製を抑制し、罹患率と死亡率を低下させました。[43]クロストリディオイデス・ディフィシルの毒性因子である毒素Aおよび毒素Bの細胞受容体結合ドメインを標的とするナノボディは、 in vitroで線維芽細胞における細胞変性効果を中和することが示されました。[44]抗原提示細胞を認識するナノボディ複合体は、腫瘍検出[45]や強力な免疫応答を生成するための標的抗原送達に効果的に使用されています。[46]

子豚の大腸菌誘発性下痢症に対する経口投与可能な単一ドメイン抗体が開発され、試験に成功している。[14]炎症性腸疾患や大腸癌などの消化管の他の疾患も、経口投与可能な単一ドメイン抗体の標的となり得る。[47]

マラセチア・フルフルの表面タンパク質を標的とした洗剤安定性のある種が、フケ防止シャンプーに使用するために設計されている。[10]

光熱療法のアプローチとして、乳がん細胞および卵巣がん細胞で過剰発現しているHER2抗原に結合するナノボディを分岐金ナノ粒子に結合させた（図参照）。試験環境において、レーザーを用いて腫瘍細胞を光熱的に破壊した。[48]

フォン・ヴィレブランド因子を標的とした単一ドメイン抗体であるカプラシズマブは、急性冠症候群患者の血栓症予防を目的とした臨床試験が行われている。 [49] ALX-0081を用いた高リスク経皮的冠動脈介入の第II相試験は2009年9月に開始された。[50]

アブリンクス社は、ナノボディが血液脳関門を通過し、抗体全体よりも容易に大きな固形腫瘍に浸透し、脳腫瘍に対する薬の開発を可能にすると期待している。[47]

ベータコロナウイルス（ COVID-19を引き起こすSARS-CoV-2を含む）のスパイクタンパク質のRBDドメインにしっかりと結合し、スパイクと細胞受容体ACE2との相互作用を阻害するナノボディが最近特定されました[51] [9]

様々な高病原性ヒトコロナウイルス（HPhCoV）による感染の予防と治療に、様々な単一ドメイン抗体（ナノボディ）を応用することが報告されている。SARS-CoV-2および類似ウイルスに結合して中和するためのナノボディの展開の可能性、有効性、そして課題が最近注目されている。[52]

ナガナ症の最も一般的な原因の一つであるトリパノソーマ・ブルーセイ（Trypanosoma brucei brucei）は、sdAbsの標的となり得る。Stijlemansら（2004）は、ウサギとラクダから、ファージを用いて脊椎動物の免疫系に可変性表面糖タンパク質抗原を提示することで、効果的なsdAbsを誘導することに成功した。将来的には、これらの治療法は、自然抗体のサイズが大きいために現在到達できない部位に到達することで、自然抗体を上回る効果を発揮するだろう。[53]

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