免疫蛍光法
蛍光染色（ AlexaFluor 488を用いた平滑筋アクチン）による豚皮膚の血管系。緑＝Alexa 488蛍光体を用いた平滑筋アクチン（SMA）。青＝DAPI対比染色。赤＝自己蛍光。

免疫蛍光法（IF）は、光学顕微鏡を用いた技術であり、細胞または組織内の様々な標的生体分子を定量的に検出・局在化することができます。この技術は、抗体と抗原の結合特異性を利用しています。[ 1 ]抗体が抗原上で認識する特定の領域はエピトープと呼ばれます。複数の抗体が同じエピトープを認識しますが、結合親和性は異なります。特定のエピトープに対する親和性が高い抗体は、同じエピトープに対する親和性が低い抗体よりも優れています。[ 2 ] [ 3 ]

抗体を蛍光体に結合することで、蛍光体を励起し、蛍光顕微鏡を用いて特定の波長における発光を測定することで、標的生体分子の位置を可視化することができる。蛍光体と抗体の結合自体が、抗体の免疫特異性や抗原への結合能を阻害しないことが不可欠である。[ 4 ] [ 5 ]

免疫蛍光法は、免疫染色（抗体を用いてタンパク質を染色する） の広く用いられている例であり、免疫組織化学（組織における抗体と抗原の関係を利用する）の具体的な例でもあります。この技術は主に蛍光体を用いて抗体の位置を可視化しますが、他の技術では、対象となる抗原を含む環境の色の変化を誘発したり、放射性標識を用いたりします。標識抗体を用いた免疫蛍光法は、1940年代にアルバート・H・クーンズによって概念化されました。[ 2 ] [ 6 ] [ 7 ]

抗IgG抗体を用いた直接蛍光抗体法で作製したヒト皮膚の組織切片の顕微鏡写真。全身性エリテマトーデス患者の皮膚では、IgG沈着が2箇所に認められる。1つ目は表皮基底膜に沿った帯状の沈着（「ループスバンドテスト」陽性）。2つ目は表皮細胞の核内（抗核抗体）である。

免疫蛍光法は、基礎科学研究や臨床診断に用いられており、組織切片、培養細胞株、個々の細胞など、多様な基質に対する多面的な有用性を示しています。その用途には、タンパク質、グリカン、小さな生物学的および非生物学的分子の分布解析、そして中サイズのフィラメントなどの構造の可視化が含まれます。[ 8 ]

細胞膜のトポロジーが未決定の場合、タンパク質へのエピトープ挿入を免疫蛍光法と組み合わせて用いることで、細胞膜内の構造を決定することができます。[ 9 ]免疫蛍光法（IF）は、DNAメチル化のレベルと局在パターンを理解するための「半定量的」手法としても使用できます。さらに、IFは、DAPIを用いたDNA標識など、抗体を使用しない他の蛍光染色法と組み合わせて用いることもできます。[ 10 ] [ 11 ]

免疫蛍光標本の検査は、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、広視野顕微鏡など、さまざまな顕微鏡構成を利用して行うことができます。[ 12 ]

種類

免疫蛍光法における主な抗核抗体パターン。[ 13 ]

蛍光の準備

免疫蛍光染色を行うには、蛍光色素を抗体に結合（「タグ化」）させる必要があります。染色法は、細胞内に発現した抗体、または生細胞上の細胞表面抗原のどちらにも適用できます。免疫蛍光染色法には、一次（直接）法と二次（間接）法の2つの一般的な種類があります。[ 1 ] [ 2 ]以下では、主に結合抗体の観点からこれらの種類について説明していきます。[ 12 ]

プライマリ（直接）

一次免疫蛍光の基本概念: 標的分子のエピトープに特異的に結合する、結合蛍光体を持つ抗体。

一次（直接）免疫蛍光法（DIF）では、蛍光体と結合した単一の抗体を使用します。抗体は標的分子（抗原）を認識し、エピトープと呼ばれる特定の領域に結合します。結合した蛍光体は蛍光顕微鏡で検出することができ、蛍光体の種類に応じて、励起されると特定の波長の光を発します。[ 1 ] [ 14 ]

蛍光色素を抗体に直接結合させることで、サンプル調製手順のステップ数が削減され、時間が節約され、分析中の非特異的なバックグラウンド信号が減少します。[ 12 ]また、抗体の交差反応性やプロセス全体におけるミスの可能性も低減されます。DIFの欠点の一つは、抗原に結合できる抗体の数が限られていることです。この制限により、この技術の感度が低下する可能性があります。標的タンパク質が低濃度でしか存在しない場合、より良いアプローチは二次免疫蛍光法です。これは、二次（間接）免疫蛍光法と比較して、DIFよりも感度が高いと考えられています[ 2 ] [ 12 ] 。 [ 1 ]

二次免疫蛍光の基本概念: 標的分子のエピトープに特異的に結合する一次抗体に結合した、結合蛍光体を持つ二次抗体。

二次（間接）

二次（間接）免疫蛍光法（SIF）は直接免疫蛍光法に似ていますが、この方法では2種類の抗体を使用しますが、そのうち1種類だけが蛍光標識を有します。蛍光標識を有する抗体は二次抗体、蛍光標識を有しない抗体は一次抗体と呼ばれます。[ 1 ]

この技術の原理は、一次抗体が標的分子のエピトープに特異的に結合し、結合した蛍光体を持つ二次抗体が一次抗体を認識して結合するというものである。[ 1 ]  

この技術は、複数の二次抗体が同じ一次抗体に結合できるため、一次免疫蛍光法よりも感度が高いと考えられています。抗原あたりの蛍光分子数の増加により発光量が増加し、シグナルが増幅されます。[ 1 ]より高い蛍光抗原比を得るための方法としては、アビジン-ビオチン複合体法（ABC法）や標識ストレプトアビジン-ビオチン法（LSAB法）などがあります。[ 15 ] [ 16 ]

制限事項

ABC法の基本概念：一次抗体は抗原に結合し、その後ビオチン化された二次抗体に結合します。その後、アビジン-ビオチン酵素複合体（ABC）が二次抗体に結合します。

細胞内の構造を研究する場合、免疫蛍光法は固定細胞（すなわち死細胞）に限定されます。これは、抗体は大きなタンパク質であるため、生細胞内の無傷の細胞膜や細胞内膜を透過できないためです。これらの構造を可視化するには、抗原物質を細胞内の本来の位置にしっかりと固定する必要があります。[ 17 ]生細胞内の構造を蛍光と組み合わせて研究するには、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質ドメインを含む組換えタンパク質を利用することができます。GFP法は、細胞の遺伝情報を改変します。[ 18 ] [ 19 ]

免疫蛍光法における重大な問題は光退色であり、[ 12 ]蛍光色素分子が発光能力を永久に失う現象である。[ 1 ]光退色のリスクを軽減するために、様々な戦略を採用することができる。光強度や照射時間を低下または制限することで、蛍光の吸収-発光サイクルが短縮され、蛍光色素分子の機能を維持することができる。また、蛍光色素分子の濃度を高めたり、Alexa Fluors、Seta Fluors、DyLight Fluorsなど、光退色に対する耐性を示すより強力な蛍光色素分子を選択したりすることもできる。[ 2 ]

LSAB法の基本概念：ストレプトアビジン-酵素複合体を用いて、一次抗体に結合したビオチン化二次抗体を同定します。このアプローチは、ABC法においてアビジン-ビオチン複合体が大きくなりすぎた場合に適用できます。

免疫蛍光法の使用時に発生する可能性のあるその他の問題には、自己蛍光、スペクトルの重複、非特異的染色などがあります。[ 1 ] [ 2 ]自己蛍光には、サンプルの組織または細胞自体から放出される自然な蛍光が含まれます。スペクトルの重複は、蛍光体がブロードな発光スペクトルを持ち、それが別の蛍光体のスペクトルと重複する場合に発生し、偽信号が発生します。非特異的染色は、蛍光体を含む抗体が、エピトープの十分な類似性のために意図しないタンパク質に結合する場合に発生します。これは、偽陽性につながる可能性があります。[ 2 ] [ 4 ] [ 1 ]マウスの血液脳関門漏出を評価する方法としてIgG染色の特異性を研究した2025年の研究では、脳切片を75°Cに加熱すると非特異的染色が完全に減少し、過酸化水素前処理とカタラーゼ阻害剤3-ATの組み合わせで大幅に減少することがわかりました。[ 20 ]

進歩

免疫蛍光法の主な進歩は、蛍光体と蛍光顕微鏡の開発にあります。蛍光体の構造を改変することで、スペクトル特性と細胞透過性を維持しながら、輝度と光安定性を向上させることができます。[ 21 ]

抗IgA抗体を用いた直接免疫蛍光染色のために作製されたヒト皮膚の組織学的切片の顕微鏡写真。ヘノッホ・シェーンライン紫斑病患者の皮膚。IgA沈着は表在性の小さな毛細血管の壁に認められる（黄色の矢印）。上部の淡い波状の緑色の領域は表皮、下部の線維性の領域は真皮である。

超解像蛍光顕微鏡法は、回折限界によって制限される顕微鏡よりも高い解像度の画像を生成することができる。これにより、細胞内の構造の詳細を決定することができる。[ 22 ]蛍光における超解像とは、より具体的には、隣接するスペクトル的に同一の蛍光色素分子の同時蛍光（スペクトルの重なり）を防ぐ顕微鏡の能力を指す。最近開発された超解像蛍光顕微鏡法には、誘導放出抑制（STED）顕微鏡法、飽和構造化照明顕微鏡法（SSIM）、蛍光光活性化局在顕微鏡法（F PALM）、および確率的光学再構成顕微鏡法（STORM）などがある。[ 23 ]

著名人

参照

参考文献

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