抗生物質感受性試験
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抗生物質感受性試験の例。抗生物質を含んだ薄い紙の円盤を、細菌を培養する寒天培地上に置く。細菌は感受性のある抗生物質の周囲では増殖できない。これは「阻止円」と呼ばれる。

抗生物質感受性試験または抗生物質感受性試験は、細菌の抗生物質に対する感受性を測定する試験です。細菌が特定の抗生物質に対して耐性を持つ可能性があるため、この試験が用いられます。感受性試験の結果に基づき、臨床医は抗生物質の選択を、感染部位と一般的な原因細菌に関する臨床的疑いに基づいて抗生物質を選択する経験的治療から、微生物とその感受性に関する知識に基づいて抗生物質を選択する指向的治療へと変更することができます。[ 1 ]

感受性試験は通常、医療研究室で行われ、細菌を抗生物質に曝露させる培養法、または細菌が耐性を付与する遺伝子を持っているかどうかを検査する遺伝子学的方法が用いられます。培養法では、細菌を均一に接種した寒天培養皿上に、抗生物質を含んだ紙製ディスクを置き、その周囲にある細菌の増殖が見られない領域（阻止円）の直径を測定することがよくあります。細菌の増殖を阻止する抗生物質の最低濃度である最小発育阻止濃度は、この阻止円の大きさから推定できます。

抗生物質感受性試験は、β-ラクタム系抗生物質ペニシリンの発見以来、必要とされてきました。初期の方法は表現型検査であり、培養または希釈法が用いられていました。抗生物質を含浸させた試験紙であるEテストは1980年代から利用可能であり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）検査などの遺伝学的検査法は2000年代初頭から利用可能になっています。現在の検査方法の迅速化や精度向上、マイクロフルイディクスなどの新しい検査方法の開発など、現在も研究が進められています。

用途

臨床医学では、抗生物質は患者の症状と医療ガイドラインに基づいて処方されることが最も多い。この抗生物質選択法は経験的療法と呼ばれ、[ 1 ]どの細菌が感染症を引き起こすか、また細菌がどの抗生物質に感受性あるいは耐性を示すかに関する知識に基づいている。[ 1 ]例えば、単純な尿路感染症はトリメトプリム/スルファメトキサゾールで治療される場合がある。[ 2 ]これは大腸菌が最も可能性の高い原因細菌であり、その抗生物質の組み合わせに感受性を示す可能性があるためである。[ 2 ]しかし、細菌はいくつかのクラスの抗生物質に耐性を示す場合がある。[ 2 ]この耐性は、ある種の細菌が一部の抗生物質に対して固有の耐性を示すため、[ 2 ]過去の抗生物質への曝露に伴う耐性のため、[ 2 ]またはプラスミドなど他のソースから耐性が伝達されるためである可能性がある。[ 3 ]抗生物質感受性試験は、どの抗生物質がより効果的であるかに関する情報を提供し、したがって感染症の治療に使用すべきである。[ 1 ]

一部の国では、スクリーニングの一環として、集団レベルで抗生物質感受性検査も実施されています。[ 4 ]これは、抗生物質耐性（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）の背景率を評価するためのもので、ガイドラインや公衆衛生対策に影響を与える可能性があります。[ 4 ]

方法

微生物学的培養によって細菌が特定されると、感受性試験のために抗生物質が選択されます。[ 5 ]感受性試験法は、細菌を抗生物質にさらし、細菌の増殖への影響を観察する（表現型検査）か、特定の遺伝子マーカーを特定する（遺伝子検査）ことに基づいています。[ 6 ]使用される方法には、結果が耐性の有無を示す定性的方法と、細菌が感受性を示す抗生物質の濃度を表す最小発育阻止濃度（MIC）を使用する定量的方法があります。 [ 6 ]

抗生物質感受性試験の結果に影響を与える要因は数多くあり、機器の故障、温度、湿度、抗菌剤の効力などが含まれます。品質管理（QC）試験は、試験結果の正確性を確保するのに役立ちます。[ 7 ]アメリカ型培養コレクションや国立型培養コレクションなどの組織は、品質管理に使用できる既知の耐性表現型を持つ細菌株を提供しています。[ 8 ]

表現型解析法

濁度が徐々に増加する溶液が入った 3 本の透明な試験管。
左から右へ: 0.5、1、2マクファーランド標準

細菌を抗生物質にさらす試験では、寒天培地または寒天もしくは培養液の希釈液を使用します。[ 9 ]抗生物質の選択は、培養する微生物と、その地域で入手可能な抗生物質によって異なります。[ 5 ] 結果の正確性を保証するために、寒天または培養液に追加される細菌の濃度（接種物）を標準化する必要があります。これは、生理食塩水または培養液に懸濁した細菌の濁度をマクファーランド標準溶液（濁度が所定濃度の細菌を含む懸濁液の濁度と同等の溶液）と比較することによって行われます。目視または測光法で決定できる適切な濃度（最も一般的なのは 0.5 マクファーランド標準溶液） [ 10 ]に達したら、接種物を増殖培地に追加します。[ 11 ] [ 10 ]

マニュアル

ディスク拡散法では、細菌株を選択し、それを寒天培地上に置き、抗生物質を含浸させたディスク付近での細菌の増殖を観察します。[ 12 ]これはカービー・バウアー法とも呼ばれますが、[ 13 ]改良法も用いられます。[ 14 ]場合によっては、尿サンプルまたは陽性血液培養サンプルを試験培地に直接塗布し、微生物を分離する予備段階を省略します。[ 15 ]抗生物質が微生物の増殖を阻害する場合、ディスクの周囲に明確なリング、つまり阻止円が見られます。この阻止円の直径をMICと相関する定義された閾値と比較することにより、細菌は抗生物質に対して感受性、中等度、または耐性に分類されます。[ 14 ] [ 16 ]

様々な濃度の抗生物質を含むストリップを置いた寒天培地上で細菌が増殖している。抗生物質の濃度が高い領域の周囲には、増殖しない楕円形の領域が見られる。
さまざまな濃度の抗生物質を染み込ませたプラスチックストリップを使用するEテストの例

ディスク拡散試験では、ミュラーヒントン寒天培地が頻繁に使用されます。 [ 14 ]臨床検査基準協会（CLSI）と欧州抗菌薬感受性試験委員会（EUCAST）は、寒天培地の種類と厚さ、培養温度、結果の分析方法に関する基準を提供しています。[ 11 ]ディスク拡散試験は、感受性試験に使用される方法の中で最も安価で簡単な方法であると考えられており、新しく利用可能になった抗生物質や製剤の試験にも簡単に適応できます。[ 5 ]増殖が遅く、培養の難しい細菌の中には、この方法では正確に試験できないものもありますが[ 5 ] 、連鎖球菌属やインフルエンザ菌などは、特殊な培地と培養条件が必要となるため、試験できます。[ 17 ]

Eテストなどの勾配法では、寒天上に置かれたプラスチックストリップを使用します。[ 5 ]異なる濃度の抗生物質を染み込ませたプラスチックストリップを培地上に置き、一定期間培養した後に培地を観察します。[ 5 ]最小発育阻止濃度は、涙滴型の阻止円とストリップ上のマーキングの交点に基づいて特定できます。[ 5 ]異なる抗生物質に対して複数のストリップが使用される場合があります。[ 5 ]この種の試験は拡散試験と考えられています。[ 18 ]

寒天法とブロス希釈法では、細菌を複数の小さなチューブに入れ、異なる濃度の抗生物質を加えます。[ 14 ]細菌が感受性があるかどうかは、一定期間培養した後、目視または自動光学的方法で判定します。[ 5 ]ブロス希釈法は、表現型検査のゴールドスタンダードと考えられています。[ 14 ]増殖を阻害する抗生物質の最低濃度はMICと考えられています。[ 5 ]

自動化

自動化システムでは、例えば、拡散試験で画像とソフトウェア解析を使用して阻止円を報告したり、希釈試験でサンプルを分配して結果を決定したりすることにより、手動プロセスを再現します。[ 14 ] VITEK 2、BD Phoenix、Microscanシステムなどの自動化機器は、ASTの最も一般的な方法です。各機器の仕様は異なりますが、基本的な原理は、細菌懸濁液を事前に処方された抗生物質のパネルに導入することです。パネルをインキュベートし、抗生物質による細菌の増殖の阻害を、濁度測定、分光光度計、蛍光検出などの方法を使用して自動的に測定します。[ 19 ]エキスパートシステムがMICと感受性の結果を相関させ、[ 20 ]結果は検証と報告のために検査情報システムに自動的に送信されます。このような自動化された検査は手動の検査よりも労働集約的ではなく、より標準化されていますが、特定の微生物や抗生物質に対する精度は比較的低い可能性があります[ 21 ]。そのため、ディスク拡散試験はバックアップ方法として依然として有用です[ 22 ] 。

  • 自動感度試験用のマルチターゲット微生物パネル。試験対象となる細菌を少量ずつ各ウェルに分注し、各ウェルには個別の試験に必要な成分が入っています。
    自動感度試験用のマルチターゲット微生物パネル。試験対象となる細菌を少量ずつ各ウェルに分注し、各ウェルには個別の試験に必要な成分が入っています。
  • 各ウェルの抗生物質感受性試験を自動化するために使用される機器にロードされた微生物パネル
    各ウェルの抗生物質感受性試験を自動化するために使用される機器にロードされた微生物パネル
  • 研究室の作業員が自動分析装置の画面に表示された感度結果を確認します。
    研究室の作業員が自動分析装置の画面に表示された感度結果を確認します。

遺伝学的方法

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、DNAマイクロアレイ、ループ介在等温増幅などの遺伝子検査は、細菌が抗生物質耐性を付与する遺伝子を持っているかどうかを検出するために使用される場合がある。[ 9 ] [ 23 ]一例として、PCRを使用してβラクタム耐性黄色ブドウ球菌のmecA遺伝子を検出することがある。[ 9 ]その他の例としては、腸球菌属のバンコマイシン耐性遺伝子vanAとvanB 、および緑膿菌、肺炎桿菌、大腸菌の抗生物質耐性を検査するアッセイがある。[ 9 ]これらの検査は、観察可能な方法と比較して直接的で迅速であるという利点があり、[ 9 ]検出すべき所見がある場合は検出される可能性が高い。[ 24 ]しかし、耐性遺伝子が検出されたかどうかは、表現型法で見られる耐性プロファイルと必ずしも一致するわけではない。[ 9 ]検査は高価であり、特別な訓練を受けた人員が必要である。[ 25 ]

ポリメラーゼ連鎖反応は、抗生物質感受性に関連する遺伝子を同定する方法である。[ 26 ] PCRプロセスでは、細菌のDNAが変性し、二重らせんの2本の鎖が分離する。目的の遺伝子に特異的なプライマーをDNAを含む溶液に加え、 DNAポリメラーゼを、必要な分子（例えば、ヌクレオチドやイオン）を含む混合物とともに加える。[ 25 ]関連する遺伝子が存在する場合、このプロセスを実行するたびに、標的遺伝子の量は倍増する。[ 25 ]このプロセスの後、電気泳動、サザンブロッティング、その他のDNA配列解析法など、さまざまな方法によって遺伝子の存在が実証される。[ 25 ]

DNAマイクロアレイとチップは、標的遺伝子または核酸配列に相補的なDNAを結合させることを利用している。 [ 9 ]これの利点は、複数の遺伝子を同時に評価できることである。[ 9 ]

2024年9月に発表された研究によると、血漿タンパク質を模倣したβ2糖タンパク質Iペプチドをちりばめた磁性ナノ粒子を使用することで、微生物病原体を血液培養検体から数時間以内に選択的に回収できる可能性がある。磁石を使用してペプチド-細菌複合体を釣り上げ、その後遺伝子検査を行う。[ 27 ]

MALDI-TOF

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）は、感受性試験のもう1つの方法です。[ 6 ]これは飛行時間型質量分析法の一種で、細菌の分子をマトリックス支援レーザー脱離にかけます。[ 26 ]イオン化された粒子は加速され、スペクトルピークが記録され、発現プロファイルが作成されます。このプロファイルを既知のプロファイルと比較することで、特定の細菌株を区別することができます。[ 26 ]抗生物質感受性試験の観点では、これにはβ-ラクタマーゼ産生大腸菌などの株が含まれます。[ 9 ] MALDI-TOFは迅速かつ自動化されています。[ 9 ]ただし、この形式での試験には限界があります。結果が表現型試験の結果と一致しない場合があり、[ 9 ]取得と維持に費用がかかります。[ 25 ]

報告

細菌は、最小発育阻止濃度（MIC）に基づいて、抗生物質に対して感受性、耐性、または中等度耐性に分類されます。MICは、特定の細菌および抗生物質の標準閾値（「ブレークポイント」と呼ばれる）と比較されます。[ 28 ]同じ微生物および抗生物質に対するブレークポイントは、感染部位によって異なる場合があります。[ 29 ]例えば、CLSI（肺炎球菌感染症協会）は、一般的に、MICが0.06 μg/ml以下の場合、静脈内ペニシリンに対して感受性、0.12～1 μg/mlの場合は中等度、MICが2 μg/ml以上の場合は耐性と定義していますが、髄膜炎の場合、ブレークポイントは大幅に低くなります。[ 30 ]抗生物質が耐性と分類されるかどうかは、 β-ラクタマーゼ産生の可能性など、既知の耐性機構に関連する細菌の特性に基づいて分類される場合もあります。[ 28 ] [ 20 ]薬剤耐性または多剤耐性の特定のパターンが注目される可能性があり、例えば、基質特異性拡張型βラクタマーゼの存在などです。[ 28 ]このような情報は、経験的治療を原因細菌のみを対象としたカスタマイズされた治療に変更することができる臨床医にとって有用である可能性があります。[ 1 ] [ 9 ]特定の期間に実施された抗菌薬感受性試験の結果は、通常、表の形式でまとめられ、抗生物質感受性図を作成できます。[ 31 ] [ 32 ]抗生物質感受性図は、臨床検査結果が得られるまで、地域の耐性パターンに基づいて臨床医が最適な経験的抗菌薬療法を選択するのに役立ちます。[ 32 ]

臨床実践

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抗生物質耐性試験：細菌を、それぞれ異なる抗生物質を染み込ませた白い円板が敷かれたシャーレに塗布する。左側のような透明なリングは、細菌が増殖していないことを示し、これらの細菌が抗生物質耐性を持たないことを示している。右側の細菌は、試験した7種類の抗生物質のうち2種類を除くすべての抗生物質に対して完全な耐性を示した。[ 33 ]

理想的な抗生物質療法は、原因菌とその抗生物質感受性の特定に基づいています。経験的治療は、臨床検査による微生物学的検査結果が出る前に開始されることがよくあります。これは、臨床ガイドラインに基づく一般的な感染症や比較的軽症の感染症（市中肺炎など）の場合もあれば、敗血症や細菌性髄膜炎など、治療の遅れが大きなリスクを伴う重篤な感染症の場合にも当てはまります。[ 1 ]個々の抗生物質の有効性は、感染部位、抗生物質が感染部位に到達する能力、細菌が抗生物質に耐性を持つか不活化する能力によって異なります。[ 34 ]

抗生物質感受性試験のための検体は、理想的には治療開始前に採取される。[ 1 ]検体は感染が疑われる部位から採取される。例えば、血流中に細菌が存在する疑いがある場合（菌血症）は血液培養検体、肺炎の場合は痰検体、尿路感染症の場合は尿検体などである。感染源が明らかでない場合は、複数の検体を採取することもある。[ 1 ]これらの検体は微生物学研究室に移され、そこで培養培地に加えられ、細菌は培養培地中またはその表面で増殖し、同定および感受性試験を実施するのに十分な量になるまで培養される。[ 35 ] [ 28 ]

抗生物質感受性試験が完了すると、サンプル中に存在する微生物と、それらの微生物がどの抗生物質に感受性があるかが報告されます。[ 28 ]抗生物質感受性試験は実験室（ in vitro ）で行われますが、この試験で得られる情報は、多くの場合、ヒトの体内での抗生物質（in vivo）に臨床的に関連しています。[ 36 ]場合によっては、一部の細菌が感染の原因であるか、または単に常在細菌または汚染物質であるかを決定しなければならないことがあります。 [ 28 ]例えば、表皮ブドウ球菌[ 37 ]やその他の日和見感染症などです。抗生物質の選択には、感染部位（膿瘍など）まで浸透する必要があるかどうかや、サンプルで感染の1つ以上の原因が検出されなかった疑いなど、他の考慮事項が影響することもあります。[ 1 ]

歴史

βラクタム系抗生物質ペニシリンの発見以来、抗菌薬耐性率は増加している。[ 38 ]時が経つにつれ、細菌の抗生物質に対する感受性を検査する方法が開発され、変化してきた。[ 25 ]

アレクサンダー・フレミングは1920年代に最初の感受性試験法を開発しました。彼が開発した「ガッター法」は、抗生物質を寒天製の溝を通して拡散させる拡散法でした。[25] 1940年代には、ポープ、フォスター、ウッドラフ、ヴィンセントなど複数の研究者が代わりに紙ディスクを使用しました。[ 25 ]これらの方法はすべて、ペニシリンに対する感受性のみを試験します。[ 25 ]結果は不正確で、研究室間で標準化されていなかったため、解釈が難しく、信頼性に欠けていました。[ 25 ]

希釈法は1870年代から細菌の培養と同定に使用され、1929年にはアレクサンダー・フレミングによって抗生物質に対する細菌の感受性を検査する方法としても用いられてきました。[ 25 ]感受性の判定方法は、溶液の濁度からpH（1942年）を経て光学機器へと変化しました。[ 25 ]大型チューブを用いた「マクロ希釈」検査は、小型の「マイクロ希釈」キットに取って代わられました。[ 5 ]

1966年、世界保健機関はカービー・バウアー法を感受性試験の標準的な方法として承認しました。この方法はシンプルで費用対効果が高く、複数の抗生物質を試験することができます。 [ 25 ]

Eテストは1980年にボルムストロムとエリクソンによって開発され、MALDI-TOFは2000年代に開発されました。[ 25 ] 1980年代以降、一連の自動化システムが開発されました。[ 25 ] PCRは最初に利用可能な遺伝子検査であり、2001年に抗生物質感受性を検出する方法として初めて発表されました。[ 25 ]

さらなる研究

ポイントオブケア検査は、検査時間を短縮し、医療従事者が精密医療のように不必要な抗生物質の処方を避けることを目的として開発されています。[ 39 ]従来の技術では通常12時間から48時間かかりますが、[ 6 ]最大5日かかることもあります。[ 28 ]一方、分子診断を用いた迅速検査は、「8時間の勤務シフト内で実行可能」と定義されています。[ 6 ]コストや規制など、さまざまな理由により、開発の進展は遅れています。[ 40 ]

さらなる研究は、現在の検査方法の欠点に焦点を当てています。表現型検査法は、報告に時間がかかるだけでなく、手間がかかり、持ち運びが難しく、リソースが限られた環境での使用が難しく、交差汚染の可能性もあります。[ 25 ]

2017年現在、分子診断会社セフェイド社のGeneXpertを通じて、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、リファンピシン耐性結核菌（TB）、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）のポイントオブケア耐性診断が利用可能であった。[ 41 ]

2014年のロンギチュード賞は、世界中のどこでも容易に使用できる、手頃な価格で正確かつ迅速な細菌感染症のPOC検査を開発した研究チームに800万ポンドの賞金を提供しました。2024年には、単一細胞イメージングに基づく45分のUTI用POC抗生物質感受性検査を開発したSysmex Astrego ABに授与されました。[ 42 ]

検出された細菌のうち耐性遺伝子を持つ細菌の割合を決定することを目的とした定量PCRが研究されている。[ 9 ]分離された細菌の全ゲノム配列決定も研究されており、時間の経過とともにコストが低下し、速度が向上するにつれて、より利用可能になる可能性が高い。[ 9 ]

研究されている追加の方法には、少量の流体と光学的、電気化学的、磁気的などの様々な試験方法を使用するマイクロ流体工学が含まれる。 [ 9 ]このようなアッセイは、試験に大量の流体を必要とせず、迅速かつ持ち運び可能である。[ 9 ]

蛍光色素の利用が研究されている。[ 9 ]これらは、細菌が抗生物質に耐性を示す際に細胞内に存在する核酸配列であるバイオマーカーを標的とした標識タンパク質を使用する。 [ 9 ]細菌の分離株を固定し、溶解する。その後、分離株を蛍光色素にさらすと、観察時に蛍光を発する。[ 9 ]

既存のプラットフォームの改良も検討されており、表現型サンプル中のMICをより迅速に識別できるイメージングシステムの改良や、細菌の増殖を明らかにして変化をより容易に視覚化できる生物発光酵素の使用などが挙げられる。[ 25 ]

参考文献

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