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血球計数器（または血球計数器、バーカー室）は、もともと血球を数えるために設計され、通常は血球を数えるために使用される計数室装置です。[ 1 ]
血球計数はルイ＝シャルル・マラセによって発明され、厚いガラス製の顕微鏡スライドガラスに長方形の窪みを設け、精密な容積測定室を形成しています。この室には、垂直線で構成されたレーザーエッチングされたグリッドが刻まれています。この装置は、線で囲まれた領域と室の深さがわかるように精密に作られています。グリッドの特定の領域を観察することで、特定の容積の液体中の細胞または粒子の数を数え、それによって液体全体の細胞濃度を計算することができます。よく使用される血球計数器のタイプは、ノイバウアー計数室です。[ 2 ]
異なるルーリングを持つ他のタイプの血球計算盤も、用途に応じて使用されています。フックス・ローゼンタールルーリングは一般的に脊髄液の計数に使用され、ハワード・モールドルーリングは食品や食品包装材のカビの計数に使用され、マクマスター・エッグスライドルーリングは糞便中の微生物卵の計数に使用され、ナジョーット・チャンバールーリングは白血球減少血小板成分中の低レベルの白血球の計数に使用され、パーマー・ナノプランクトンルーリングはより小さなプランクトンを計数します。改良ノイバウアールーリングを使用したペトロフ・ハウサー計数器は、細菌や精子の計数に使用され、様々なチャンバー深度で提供されています。血球計算盤のセジウィック・ラフター・セルルーリングは、主に飲料水の顕微鏡検査に使用するために設計されています。
原則
改良型ノイバウアー式血球計算盤のグリッド領域は、1 x 1 mm (1 mm 2 ) の正方形9個で構成されています。これらは3方向に細分化されており、0.25 x 0.25 mm (0.0625 mm 2 )、0.25 x 0.20 mm (0.05 mm 2 )、0.20 x 0.20 mm (0.04 mm 2 ) となっています。中央の正方形はさらに0.05 x 0.05 mm (0.0025 mm 2 ) の正方形に細分化されています。血球計算盤の縁は、カバーガラスをグリッドから0.1 mm離して保持することで、各正方形に一定の体積を与えます（右図参照）。[ 3 ]
| 寸法 | エリア | 0.1 mmの深さでの体積 |
|---|---|---|
| 1 x 1 mm | 1 mm 2 | 100 nL |
| 0.25 x 0.25 mm | 0.0625 mm 2 | 6.25 nL |
| 0.25 x 0.20 mm | 0.05 mm 2 | 5nL |
| 0.20 x 0.20 mm | 0.04 mm 2 | 4 nL |
| 0.05 x 0.05 mm | 0.0025 mm 2 | 0.25 nL |
使用法
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血球計数器を使用するには、まず、計数チャンバーに付属の専用カバーガラスが計数チャンバーの表面に正しく配置されていることを確認します。2つのガラス面が適切に接触すると、ニュートンリングを観察できます。接触していれば、細胞懸濁液をカバーガラスの端に塗布し、毛細管現象によってカバーガラスの隙間に吸い込まれ、チャンバー全体がサンプルで満たされます。チャンバー内の細胞数は、顕微鏡を用いた直接計数によって測定できます。また、視覚的に識別可能な細胞は、分別計数によって測定できます。チャンバー内の細胞数は、サンプルの由来となる混合物中の細胞の濃度または密度を計算するために使用されます。これは、希釈や計数手順の省略を考慮して、最初から分かっているチャンバーの容積でチャンバー内の細胞数を割った値です。
ここで、希釈されたサンプルの容量（希釈後）をサンプル内の元の混合物の容量（希釈前）で割ったものが希釈係数です。たとえば、元の混合物の容量が 20μL で、1 回希釈された場合（20μL の希釈剤を追加して）、括弧内の 2 番目の項は 40μL/20μL です。カウントされた正方形の容量は、サイズによって異なりますが、上部の表に示されているとおりです（右の図を参照）。カウントされた細胞数は、1 つのチャンバー内の正方形全体でカウントされたすべての細胞の合計です。セット スクエア内のすべての内側の正方形がカウントされていない場合は、カウントされた細胞の割合が適用されます（つまり、角の正方形の 20 個のうち 4 個のみがカウントされる場合、この項は 0.2 になります）。容量が 100ナノリットル（nL）の大きな正方形をカウントする場合は、10000 を掛けると、1 ミリリットルあたりの目的の細胞数が得られます。
ほとんどのアプリケーションでは、4つの大きな角の正方形のみが使用されます。上と左の線上にある、またはそれらに接しているセルはカウントされますが、右と下の線上にある、またはそれらに接しているセルは無視されます。[ 5 ]
要件
サンプルを採取する前に、元の懸濁液を十分に混合する必要があります。これにより、サンプルは元の混合物の特定の領域から抽出されたものではなく、代表性を持つものになります。
計数する細胞数に応じて、適切な希釈率の混合液を使用する必要があります。サンプルの希釈が不十分だと、細胞が密集しすぎて計数することが困難になります。また、希釈が不十分だと、元の混合液の濃度について 確固たる推論を行うのに十分なサンプル量が得られません。
2つ目のチャンバーで重複試験を実施することで、結果を比較することができます。結果が計数誤差（[ 6 ]細胞をポアソン点過程としてモデル化した場合の計数誤差の平方根）の2倍以上異なる場合、サンプル採取方法が信頼できない可能性があります（例：元の混合物が完全に混合されていない）。
計数チャンバーは、チャンバー蓋（厚さと平坦性が認定された特殊なカバーガラス）を取り付けた後、毛細管現象によって充填する必要があります。これにより、細胞がガラスに沈降・付着したり、カバーガラスを被せる前に細胞の一部が蒸発して細胞濃度が過大評価されたりするリスクを回避できます。細菌の場合、沈降はそれほど問題になりませんが、湿度が低く空調設備の整った実験室では蒸発が起こりやすいため、最小限に抑える必要があります。
アプリケーション
- 血球数検査: 自動計測装置がうまく機能しない、血球に異常のある患者向け。
- 精子数
- 尿顕微鏡検査
- 細胞培養: 継代培養する場合、または時間の経過に伴う細胞の成長を記録する場合。
- ビール醸造：酵母の準備のため。
- 植物プランクトン細胞数え
- 下流分析のための細胞処理: 多くのテスト ( PCR、フローサイトメトリー)では正確な細胞数が必要ですが、他のテストでは高い細胞生存率が必要です。
- 細胞サイズの測定：顕微鏡写真では、血球計算盤の幅にスケールを合わせることで実際の細胞サイズを推測することができます。[ 7 ]
参照
参考文献
- ^アブシャー、マレーネ (1973)。 「血球計数計」。組織培養。 pp. 395–397。土井: 10.1016/B978-0-12-427150-0.50098-X。ISBN 9780124271500。
- ^ 「図8. 改良されたノイバウアールーリング血球計算板スライドの図。（A）上面図…」ResearchGate . 2018年3月29日閲覧。
- ^ 「血球計算盤の正方形サイズ・血球計算盤」 2013年4月11日。
- ^ 「ノイバウアーチャンバーによる細胞カウント - 血球計の基本的な使用法、Óscar Bastidas」(PDF)。
- ^ Strober W (2001). 「細胞増殖のモニタリング」Coligan JE, Bierer BE, Margulies DH, Sherach EM, Strober W (編). Current Protocols in Immunology . 第5巻. 米国: John Wiley & Sons. p. A.2A.1. doi : 10.1002/0471142735.ima03as21 . ISBN 0471142735. PMID 18432653 .
- ^ Shapiro, Howard (2001年1月31日). 「非常にまれな出来事：どこまで低く抑えられるか？」 .
- ^ 「血球計数器による細胞サイズの測定」 。 2012年6月29日時点のオリジナルよりアーカイブ。2013年6月2日閲覧。
外部リンク
- オンライン演習 2024年6月5日アーカイブ-ノイバウアー改良型またはトーマ式計数チャンバーにおける酵母数
- 血球計数計オンライン計算機
- 血球計数器の種類