極低温電子顕微鏡
リーズ大学のTitan Krios

極低温電子顕微鏡法（クライオEM）は、極低温に冷却された試料に適用される透過型電子顕微鏡法である。生物試料の場合、試料の構造はガラス質氷の環境に包埋することで保存される。試料水溶液をグリッドメッシュに塗布し、液体エタンまたは液体エタンとプロパンの混合液にプランジ凍結する。[ 1 ]この技術の開発は1970年代に始まったが、近年の検出器技術とソフトウェアアルゴリズムの進歩により、生体分子の構造を原子レベルに近い分解能で決定できるようになった。[ 2 ]これにより、構造生物学分野において、X線結晶構造解析やNMR分光法の代替として、この手法が広く注目を集めている。 [ 3 ]

2017年のノーベル化学賞は、ジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンの3人に授与されました。受賞理由は「溶液中の生体分子の高解像度構造決定のためのクライオ電子顕微鏡法の開発」でした。[ 4 ] また、ネイチャー・メソッド誌は2015年にクライオ電子顕微鏡を「今年の手法」に選出しました。[ 5 ]

歴史

初期の開発

1960年代には、高エネルギー電子線による放射線損傷のため、透過型電子顕微鏡を用いた生物試料の構造決定は限定的でした。科学者たちは、試料を低温で検査することで、電子線誘起の放射線損傷を軽減できると仮説を立てました。 [ 6 ]液体ヘリウム（-269  ℃または 4Kまたは-452.2  ℉）と液体窒素（-195.79℃または77Kまたは-320℉）はどちらも極低温物質として考えられていましたが、 [ 7 ]高い安定性は達成されませんでした。1980年、エルウィン・クナペックとジャック・デュボシェは、極低温における電子線損傷に関するコメントを発表し、次のような観察結果を共有しました。

炭素膜上に載せられた薄い結晶は、室温よりも4Kで30～300倍の耐ビーム性があることがわかりました。私たちの結果のほとんどは、4K領域での凍結保護が温度に強く依存していると仮定することで説明できます。[ 8 ]

しかし、これらの結果は再現性がなく、わずか2年後に修正版[ 9 ]が発表され、Nature誌の解説[ 10 ]では、ビーム耐性は当初予想されていたほど大きくないことが示唆されました。4Kで得られた保護効果は、L-バリンの標準試料の場合、以前の発表よりも「10倍」に近かったとされています。[ 10 ]クライオ電子顕微鏡（クライオEM）試料は通常、液体窒素温度で採取されますが、[ 11 ]試料の挙動を理解し、液体ヘリウム温度で採取するための研究が継続されています。[ 12 ] [ 13 ] [ 11 ]

1981年、欧州分子生物学研究所の科学者アラスデア・マクドウォールとジャック・デュボシェが、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）の初めての導入に成功したと報告した。[ 14 ]マクドウォールとデュボシェは、親水性カーボンフィルムに純水を噴霧し、急速に極低温（77 K に冷却した液体プロパンまたは液体エタン）に浸すことで、薄膜状に純水をガラス化した。非晶質氷の薄い層の厚さは1 μm未満で、電子回折パターンにより非晶質/ガラス質氷の存在が確認された。1984年、デュボシェのグループは、ガラス化したアデノウイルス2型、T4バクテリオファージ、セムリキ森林ウイルス、バクテリオファージCbK、水疱性口内炎ウイルスの分析により、構造生物学におけるクライオ電子顕微鏡の威力を実証した。[ 15 ]この論文はクライオ電子顕微鏡の起源を示すものと一般的に考えられており、この技術は世界中の多くの研究室で日常的に使用されるまでに発展しました。

イメージングに使用される電子のエネルギー（80～300 kV）は、有機試料および生物試料中の共有結合の切断につながる可能性があります。 [ 16 ]このような試料をイメージングする場合、画像取得に使用する電子照射量を制限する必要があります。この低い照射量では、専用のソフトウェアを用いて、数千、あるいは数百万もの同一の凍結分子の画像を選択し、整列させ、平均化することで高解像度のマップを作成する必要があります。2012年には、直接電子検出器とより優れた計算アルゴリズムの導入により、構造特徴の大幅な改善が達成されました。[ 17 ]

最近の進歩

電子検出器技術、特に直接電子検出器の進歩と、より強力なソフトウェア画像化アルゴリズムにより、原子分解能に近い解像度で高分子の構造を決定できるようになりました。 [ 18 ]画像化された高分子には、ウイルス、リボソーム、ミトコンドリア、イオンチャネル、酵素複合体などがあります。2018年からは、クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) はヘモグロビン(64 kDa ) [ 19 ]のような小さな構造にも適用でき、解像度は最大1.8 Åに達します。[ 20 ] 2019年には、タンパク質データバンクに登録された構造の2.5%がクライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) 構造で占められており、[ 21 ]この数は増え続けています。[ 22 ]クライオ電子顕微鏡の応用例として、傾斜した2D画像からサンプルの3D再構成を行う クライオ電子トモグラフィー(cryo-ET) があります。

2010年代は電子カメラの飛躍的な進歩が顕著でした。特に、直接電子検出器の改良は「解像度革命」[ 23 ]をもたらし、アミノ酸の位置と配向を解明するために不可欠な約2～3Åの限界を下回る解像度を実現しました。[ 24 ]

ヘンダーソン（MRC分子生物学研究所、英国ケンブリッジ）は、ラザフォード・アップルトン研究所の技術者およびマックス・プランク協会の科学者らとコンソーシアムを結成し、最初のプロトタイプの資金調達と開発を行った。その後、コンソーシアムは電子顕微鏡メーカーのFEIと提携し、新設計の製品化と販売を開始した。ほぼ同時期に、カリフォルニア州プレザントンのガタン社は、ピーター・デネス（ローレンス・バークレー国立研究所）とデビッド・アガード（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）が設計した同様の検出器を発表した。3つ目のタイプのカメラは、ダイレクト・エレクトロン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のグエン・フー・シュオンによって開発された。[ 23 ]

最近では、タンパク質ベースのイメージングスキャフォールドの使用における進歩が、サンプルの方向バイアスとサイズ制限の問題を解決するのに役立っています。 Cryo-EM の最小サイズはまだ決定されていませんが、約 50 kDa未満のタンパク質は一般に信号対雑音比(SNR)が低すぎるため、画像内でタンパク質粒子を分解することができず、3D 再構成が困難または不可能になります。[ 25 ] [ 26 ]小さなタンパク質の構造を決定する際に SNR を改善する複数の手法が報告されています。[ 27 ] [ 28 ]高親和性のDARPins、ナノボディ、抗体フラグメントに基づいて、[ 29 ]これらの方法は標的タンパク質を強固に結合し、それによって有効粒子サイズを増やして対称性を導入し、 Cryo-EM マップ再構成の SNR を改善します。

2017年ノーベル化学賞

クライオ電子顕微鏡が生化学に与えた影響が認められ、ジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンの3人の科学者が「溶液中の生体分子の高解像度構造決定のためのクライオ電子顕微鏡の開発」によりノーベル化学賞を受賞した。 [ 4 ]

X線結晶構造解析との比較

伝統的に、X線結晶構造解析は生体分子の3次元構造を決定するための最も一般的な手法であった。[ 30 ]しかし、前述のクライオ電子顕微鏡（クライオEM）の進歩により、生体分子の詳細を調べるツールとしての人気が高まっている。2010年以降、クライオ電子顕微鏡による構造の年間登録数はX線結晶構造解析を上回っている。[ 31 ] X線結晶構造解析は数十年にわたる歴史を持つため、登録数が大幅に多いものの、2035年頃には両手法の総登録数が上回ると予測されている。[ 31 ]

X線結晶構造解析の解像度は結晶の均質性によって制限され、[ 32 ]、理想的な結晶化条件が不明な生物学的分子を結晶状態に誘導することは非常に時間がかかり、極端な場合には数か月から数年かかることもあります。[ 33 ]対照的に、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）でのサンプル調製では、タンパク質凝集や優先配向などの問題を克服するために、複数回のスクリーニングと最適化が必要になる場合があります。[ 34 ] [ 35 ]しかし、サンプルが結晶を形成する必要はなく、クライオ電子顕微鏡用のサンプルは急速冷凍され、ほぼ天然の状態で検査されます。[ 36 ]

Proteopediaによると、タンパク質データバンクにおけるX線結晶構造解析による平均解像度（2019年5月19日現在）は2.05Åであり、 [ 32 ] 、記録上達成された最高解像度（2022年9月30日現在）は0.48Åである。[ 37 ] 2020年現在、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）によって決定されたタンパク質構造の大部分は、3～4Åの低い解像度である。[ 38 ] しかし、2020年現在、最高のクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）解像度は1.22Åで記録されており、[ 35 ]場合によっては解像度の面で競合することになる。

生物標本

薄膜

生物試料は電子顕微鏡グリッド上に広げられ、通常は液体窒素温度に近い液体エタン中で急速凍結により凍結水和状態で保存されます。試料を液体窒素温度またはそれ以下の温度に保つことで、電子顕微鏡カラムの高真空中に導入することができます。ほとんどの生物試料は放射線感受性が非常に高いため、低線量技術を用いて画像化する必要があります（透過型電子顕微鏡の低温は、放射線損傷に対するさらなる保護因子となります）。

その結果、画像には非常にノイズが多くなります。一部の生物系では、画像を平均化することで信号対雑音比を高め、単粒子解析と呼ばれる手法を用いて標本に関する高解像度の情報を取得することが可能です。このアプローチでは、平均化の対象となるものが一般的に同一である必要がありますが、限定的な構造的異質性（リボソームなど）を研究できるようになりました。タンパク質複合体やウイルスのCryoTEM画像からの3次元再構成は、サブナノメートルまたは原子レベルに近い解像度で解読されており、これらの大規模集合体の構造と生物学的特性に関する新たな知見をもたらしています。

膜貫通タンパク質の2次元結晶やタンパク質のらせん状配列など、タンパク質の整列した配列を解析することで、ある種の平均化が可能になり、試料に関する高解像度の情報が得られます。この技術は電子結晶構造解析と呼ばれます。

硝子体切片

薄膜法は、厚い試料では電子が多重散乱を起こさずに透過できないため、薄い試料（通常 500 nm 未満）に限られます。厚い試料は、エタン中でプランジ凍結（凍結固定）するか、より一般的には高圧凍結（厚さ数百 μm）してガラス化できます。その後、クライオウルトラミクロトームでダイヤモンドナイフを使用して、-135 °C（失透温度）未満の温度で薄切片（厚さ 40～200 nm）に切断できます。この切片は電子顕微鏡グリッド上に集められ、薄膜でガラス化された試料と同じ方法で画像化されます。この技術は、ガラス体切片の透過型電子クライオ顕微鏡法（CEMOVIS）または凍結水和切片の透過型電子クライオ顕微鏡法と呼ばれます。

材料標本

クライオTEMは、ガラス化された生物試料の観察を可能にするだけでなく、真空中では揮発性が高すぎて標準的な室温電子顕微鏡では観察できない物質試料の観察にも使用できます。例えば、液体と固体の界面のガラス化された切片をクライオTEMで抽出して分析することができます[ 39 ]。また、電子顕微鏡の真空中で昇華しやすい硫黄は、クライオTEMで安定化させ、観察することができます[ 40 ] 。

クライオTEMにおける画像処理

電子顕微鏡法のほとんどのアプローチでは、物質の最高解像度の画像を取得しようとしますが、クライオTEMでは必ずしもそうではありません。高解像度画像の利点はありますが、信号対雑音比が各粒子の配向を決定する上で依然として大きな障害となっています。例えば、高分子複合体では、画像化中に3Dから2Dに投影される複数の異なる構造があり、それらを区別しないと画像処理の結果はぼやけてしまいます。そのため、この種の研究では確率的アプローチがより強力になります。[ 41 ]現在、クライオ電子顕微鏡の画像処理で広く使用されている2つの一般的なアプローチがあります。1998年に発見された最大尤度アプローチ[ 42 ]と、比較的最近採用されたベイズアプローチです。[ 43 ]

最尤推定法は統計学からこの分野に持ち込まれました。この方法では、粒子のあらゆる可能な方向を合計して、結果として得られる確率分布を得ます。これは、画像ごとに粒子の正確な方向が与えられる典型的な最小二乗推定法に似ています。[ 44 ]この方法では、サンプル内の粒子は計算後に「あいまいな」方向を取得し、対応する確率によって重み付けされます。このプロセス全体は反復的であり、反復するたびにモデルは改善されます。実際の構造をよりよく表すモデルを作成するための良好な条件は、データに過度のノイズがなく、粒子に特定の方向がないことです。最尤推定法の主な欠点は、結果が初期推定値に依存し、モデルの最適化が局所的最小値で行き詰まってしまう場合があることです。[ 45 ]

現在クライオTEMで使用されているベイズ法は、本質的に経験的な手法です。つまり、粒子の分布は元のデータセットに基づいています。同様に、通常のベイズ法では、データの観測後に変更される固定の事前確率があります。最大尤度推定との主な違いは、再構成時のノイズを低減しながら、得られたマップを滑らかにする特別な再構成項にあります。[ 44 ]マップの平滑化は、事前確率をガウス分布と仮定し、フーリエ空間でデータを解析することによって行われます。事前知識とデータセットとの関連性が確立されているため、人的要因によるエラーの可能性が低くなり、画像再構成の客観性が向上する可能性があります。[ 43 ]

クライオTEMイメージングおよび画像再構成の新しい手法の出現に伴い、プロセスの自動化を支援する新しいソフトウェアソリューションが登場しています。経験的ベイズ法がオープンソースのコンピュータプログラムRELION（REgularized LIkelihood OptimizatioN）に3D再構成用に実装されて以来、[ 46 ] [ 47 ]このプログラムはクライオTEM分野で広く普及しました。RELIONは、再構成画像の解像度を向上させる様々な補正機能を提供し、Python言語を用いた汎用的なスクリプトの実装を可能にし、2D/3Dモデル分類やde novoモデル作成といった一般的なタスクを実行します。[ 48 ] [ 49 ]

テクニック

CryoTEMでは様々な技術が使用可能である。[ 50 ]一般的な技術としては以下のようなものがある。

  1. 単粒子分析（SPA）
    1. 時間分解クライオTEM [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]
  2. 電子クライオトモグラフィー（クライオET）
  3. 電子結晶学
    1. 二次元結晶の解析
    2. らせん状のフィラメントまたはチューブの分析
    3. 微結晶電子回折（マイクロED）[ 54 ] [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ]

相関光クライオTEMとクライオET

2019年には、相関光クライオTEMとクライオETを用いて神経細胞内のトンネルナノチューブ（TNT）を観察した。[ 58 ]

走査型電子顕微鏡

走査型電子顕微鏡法(cryoSEM) は、極低温チャンバー内に走査型電子顕微鏡の冷却ステージを備えた 走査型電子顕微鏡法技術です。

極低温透過型電子顕微鏡

極低温透過型電子顕微鏡（クライオTEM）は、構造生物学および材料科学において用いられる透過型電子顕微鏡法の一種です。口語的には、「クライオ電子顕微鏡法」またはその短縮形である「クライオEM」という用語は、基本的に極低温透過型電子顕微鏡法を指します。これは、クライオEMの大部分が走査型電子顕微鏡ではなく透過型電子顕微鏡で行われるためです。

単粒子解析ワークフロー

高度な方法

参照

Wikibooksには「分子顕微鏡用ソフトウェアツール」に関する書籍があります。

参考文献

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