DNA抽出

デオキシリボ核酸（DNA）の最初の単離は、 1869年にフリードリヒ・ミーシャーによって行われました。[ 1 ] DNA抽出とは、サンプル（通常は血液、唾液、組織など）から単離された生物の細胞からDNAを単離するプロセスです。細胞を破壊し、タンパク質やその他の汚染物質を除去し、DNAを他の細胞成分から分離して精製します。精製されたDNAは、PCR、[ 2 ]シーケンシング、クローニングなどの下流のアプリケーションに使用できます。現在、分子生物学や法医学分析において日常的に行われている手順です。

このプロセスは、サンプルの種類と下流のアプリケーションに応じていくつかの方法で実行できます。[ 3 ]最も一般的な方法は、機械的、化学的、酵素的溶解、沈殿、精製、濃縮です。DNA抽出には、フェノール-クロロホルム抽出、アルコール沈殿、シリカベースの精製などの特定の方法が使用されます。[ 4 ]

化学的方法では、抽出には様々なキットが使用され、適切なキットを選択することで、キットの最適化と抽出手順にかかる時間を節約できます。PCR感度検出は、市販のキット間のばらつきを示すと考えられています。[ 5 ]

DNA を抽出するにはさまざまな方法がありますが、一般的な手順は次のとおりです。

  1. 溶解：この段階では、細胞を破壊してDNAを放出します。例えば、細菌細胞の場合、界面活性剤と塩の溶液（SDSなど）を用いて細胞膜を破壊し、DNAを放出することができます。植物細胞や動物細胞の場合、機械的または酵素的な方法がよく用いられます。
  2. 沈殿：DNAが遊離したら、タンパク質やその他の夾雑物を除去する必要があります。これは通常、アルコール（エタノールやイソプロパノールなど）や塩（酢酸アンモニウムなど）などの沈殿剤を加えることで行われます。DNAは溶液の底に沈殿しますが、夾雑物は液体中に残ります。
  3. 精製：DNAを沈殿させた後、通常はカラムを用いた方法を用いてさらに精製します。例えば、シリカベースのスピンカラムを用いてDNAを結合させ、夾雑物を洗い流します。あるいは、遠心分離ステップを用いてDNAをチューブの底まで遠心沈降させることで精製することもできます。
  4. 濃縮：最後に、残留液を除去することでDNAの量を増やすのが一般的です。これは通常、真空遠心分離または凍結乾燥（フリーズドライ）法を用いて行われます。

これらの手順は、DNA抽出プロトコルに応じて多少変更される場合があります。また、特定のサンプルの種類に合わせて調整された試薬とプロトコルを含むキットが市販されています。[ 6 ]

それは何をもたらすのでしょうか?

DNA抽出は、環境中のウイルスや細菌の特定、病気や遺伝性疾患の診断に用いられる多くの診断手順において、予備的なステップとして頻繁に用いられます。これらの方法には、以下のようなものがありますが、これらに限定されるものではありません。

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法は1980年代に開発されました。基本的な考え方は、顕微鏡スライドに付着した間期細胞または中期染色体の核DNAを核酸プローブでハイブリダイズさせることです。これは、特定の細菌群の認識と計数などに用いられる分子生物学的手法です。[ 1 ]

海洋細菌プランクトン群集の地理的および時間的パターンを認識、定義、定量化するために、研究者は末端制限断片長多型 (T-RFLP) と呼ばれる手法を採用しています。

シーケンシング：ゲノム全体または一部とその他の染色体構成要素を、以前に公開された配列との比較のために終了させたもの。[ 7 ]

基本的な手順

DNA に結合した細胞タンパク質およびヒストンタンパク質は、プロテアーゼを追加するか、タンパク質を酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムで沈殿させるか、DNA 沈殿の前に フェノールとクロロホルムの混合物で抽出することによって除去できます。

分離後、DNA は弱アルカリ性の緩衝液（通常はTE 緩衝液）または超純水に溶解されます。

一般的な化学物質

DNA 抽出に使用される最も一般的な化学物質は次のとおりです。

  1. SDS や Tween-20 などの洗剤は、細胞を破壊して DNA を放出するために使用されます。
  2. プロテアーゼ K などのプロテアーゼ酵素は、DNA に結合している可能性のあるタンパク質を消化するために使用されます。
  3. フェノールとクロロホルムはDNAを他の細胞成分から分離するために使用されます。[ 8 ]
  4. DNA を沈殿させるために使用されるエタノールまたはイソプロパノール。
  5. NaCl などの塩は、DNA を溶解してその安定性を維持するためによく使用されます。
  6. EDTA は DNA に損傷を与える可能性のある金属イオンをキレートするために使用されます。
  7. Tris-HCL は、DNA 抽出に最適な条件で pH を維持するために使用されます。

方法の選択

最も一般的なDNA抽出法には、有機抽出法、キレックス抽出法、固相抽出法などがあります。[ 9 ] [ 10 ]これらの方法は一貫して単離DNAを生成しますが、得られるDNAの品質と量はそれぞれ異なります。DNA抽出法を選択する際には、コスト、時間、安全性、汚染のリスクなど、考慮すべき要素が複数あります。

有機抽出には、複数の異なる化学溶液中でのインキュベーションの追加が含まれます。[ 10 ]これには、溶解ステップ、フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿、および洗浄ステップが含まれます。有機抽出は、安価で大量の純粋なDNAが得られるため、研究室でよく使用されます。簡単であるにもかかわらず、多くのステップが含まれており、他の方法よりも時間がかかります。また、有毒化学物質であるフェノールとクロロホルムを使用することになり、複数のチューブ間でDNAを移動することによる汚染のリスクが高まります。[ 11 ] DNAの有機抽出に基づくいくつかのプロトコルは数十年前に効果的に開発されましたが、[ 12 ]これらのプロトコルの改良されたより実用的なバージョンもここ数年で開発され、公開されています。[ 13 ]

Chelex抽出法では、サンプルにChelex樹脂を加え、溶液を沸騰させ、ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離します。細胞物質はChelexビーズに結合し、DNAは上清中に残ります。[ 11 ] Chelex法は有機抽出法よりもはるかに迅速かつ簡便で、必要なチューブは1本だけなのでDNAコンタミネーションのリスクを低減できます。しかしながら、Chelex抽出法では得られるDNA量は少なく、得られるDNAは一本鎖であるため、PCRベースの分析にしか使用できず、 RFLPには使用できません。[ 11 ]

スピンカラムを用いた抽出法などの固相抽出法は、DNAがシリカに結合するという事実を利用しています。DNAを含むサンプルをシリカゲルまたはシリカビーズとカオトロピック塩を含むカラムに加えます。カオトロピック塩はDNA鎖間の水素結合を破壊し、核酸を疎水性にすることでDNAとシリカの結合を促進します。これによりリン酸残基が露出し、吸着可能になります。[ 14 ] DNAはシリカに結合し、残りの溶液はエタノールを使用して洗い流され、カオトロピック塩やその他の不要な成分が除去されます。[ 10 ]その後、DNAを低塩水溶液で再水和することで、ビーズからDNAを 溶出させることができます。

この方法は、 PCRとRFLP分析の両方に使用できる、高品質で主に二本鎖のDNAを生成します。この手順は自動化が可能で[ 11 ] 、フェノール-クロロホルム法よりもスループットは低いものの、高いスループットを実現します。これはワンステップ法であり、すべての手順が1本のチューブ内で完了します。これにより汚染のリスクが低く、法医学的DNA抽出に非常に有用です。複数の固相抽出キットが様々な企業によって製造・販売されていますが、唯一の問題は、有機抽出やChelex抽出よりも高価であることです。

特殊なタイプ

一部のサンプルからのDNA分離には、特定の技術を選択する必要があります。DNA分離が複雑なサンプルには、以下のようなものがあります。

染色体外 DNA は一般に分離が容易で、特にプラスミドは細胞溶解とそれに続くタンパク質沈殿によって簡単に分離できます。これにより染色体 DNA は不溶性画分に捕捉され、遠心分離後に可溶性画分からプラスミド DNA を精製できます。

ハートDNA抽出法は、哺乳類細胞内のすべての染色体外DNAを単離するプロセスです。ハート抽出プロセスでは、高分子量の核DNAが除去され、低分子量のミトコンドリアDNAと細胞内に存在する ウイルスエピソームのみが残ります。

DNAの検出

ジフェニルアミン（DPA）指示薬はDNAの存在を確認します。この手順はDNAの化学的加水分解を伴います。酸中で加熱（例：95℃以上）すると、反応にはデオキシリボース糖が必要となるため、DNAに特異的です。この条件下では、2-デオキシリボースはw-ヒドロキシレブリニルアルデヒドに変換され、これがジフェニルアミンと反応して青色の化合物を生成します。DNA濃度は、分光光度計を用いて600 nmにおける溶液の吸光度を測定し、既知のDNA濃度の標準曲線と比較することで決定できます。

DNA溶液の260 nmおよび280 nmの波長における吸光度の強度を測定することは、DNAの純度を測る指標として用いられます。DNAは、制限酵素でDNAを切断し、アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウム（EtBr）または他の染色剤で染色し、その強度を既知濃度のDNAマーカーと比較することで定量化できます。

サザンブロット法を用いて定量化されたDNAを単離し、 PCRおよびRFLP分析を用いてさらに詳しく調べることができます。これらの手法により、ゲノム内の反復配列を区別することが可能になります。法医学者はこれらの技術を用いて、比較、識別、分析を行っています。

高分子量DNA抽出法

この方法では、植物の核を物理的に粉砕し、独自の核分離緩衝液（NIB）中で再構成することで単離する。プラスチドDNAは細胞小器官から遊離し、浸透圧緩衝液を用いて洗浄および遠心分離により除去される。精製された核は溶解され、さらに有機抽出によって洗浄され、ゲノムDNAは高濃度CTABで沈殿される。高純度で高分子量のgDNAが核から抽出され、高pH緩衝液に溶解されるため、安定した長期保存が可能となる。[ 16 ]

DNAストレージ

DNAの保管は、下流のアプリケーションのために抽出されたDNAの完全性と安定性を保証するため、DNA抽出プロジェクトにとって重要な側面です。[ 17 ]

DNAの保存方法としては、エタノール沈殿法が一般的です。これは、抽出したDNAにエタノールと塩化ナトリウムや酢酸カリウムなどの塩を加えて溶液から沈殿させる方法です。その後、DNAを遠心分離でペレット化し、70%エタノールで洗浄して残留不純物を除去します。その後、DNAペレットを風乾し、Tris-EDTA（TE）緩衝液などの緩衝液に再懸濁して保存します。

もう一つの方法は、TE緩衝液などの緩衝液、またはグリセロールやDMSOなどの凍結保護剤を用いて、-20℃または-80℃でDNAを凍結することです。この方法はDNAの完全性を維持し、DNAを分解する可能性のある酵素の活性を低下させます。

保存バッファーと保存条件の選択は、DNAの用途に応じて異なります。例えば、DNAをPCRに使用する場合は、TEバッファー中で4℃で保存しますが、長期保存や輸送に使用する場合は、エタノール中で-20℃で保存します。抽出したDNAは、ゲル電気泳動や分光光度計などを用いて、定期的に品質と完全性を確認する必要があります。温度や湿度などの保存条件についても記録し、管理する必要があります。

DNAの長期的な安定性と経時劣化の可能性を考慮することも重要です。抽出したDNAは可能な限り短期間保存し、劣化のリスクを最小限に抑える保存条件を選択する必要があります。

一般的に、抽出された DNA は、下流のアプリケーションでの安定性と完全性を確保するために、可能な限り最良の条件で保管する必要があります。

品質管理

抽出されたDNAの品質を保証するために使用される品質管理技術はいくつかあり、その中には次のようなものがある。[ 18 ]

  • 分光光度法：DNAサンプルの濃度と純度を測定するために広く用いられている方法です。分光光度法では、異なる波長（典型的には260 nmと280 nm）におけるサンプルの吸光度を測定します。260 nmと280 nmの吸光度の比を用いてDNAサンプルの純度を決定します。[ 19 ]
  • ゲル電気泳動：この技術は、DNAサンプルのサイズと完全性を可視化し比較するために使用されます。DNAをアガロースゲルにロードし、電界をかけることでDNAをゲル内を移動させます。DNAの移動は、DNAにインターカレーションし、紫外線下で蛍光を発するエチジウムブロマイドを用いて可視化できます。[ 20 ]
  • 蛍光測定法：蛍光測定法は、特定の波長の光で励起されたサンプルの蛍光を測定することで核酸濃度を測定する方法です。蛍光測定法では、核酸に特異的に結合し、高い蛍光強度を持つ色素を使用します。
  • PCR: ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、DNA の特定の領域を増幅する技術です。また、DNA の小さな断片を増幅することによる QC 方法としても使用されます。増幅が成功した場合、抽出された DNA は高品質であり、劣化していないことを意味します。
  • Qubit蛍光計： Qubit蛍光計は、蛍光色素を用いてサンプル中のDNAとRNAの濃度を測定する装置です。DNAサンプルの濃度測定に使用できる迅速かつ高感度な方法です。[ 18 ]
  • バイオアナライザー：バイオアナライザーは、電気泳動を用いてDNA、RNA、タンパク質サンプルを分離・分析する機器です。DNAサンプルのサイズ、完全性、純度に関する詳細な情報を提供できます。

参照

参考文献

  1. ^ a b「蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）」 . Genome.gov . 2022年10月23日閲覧。
  2. ^ Gupta, Nalini (2019). 「 DNA抽出とポリメラーゼ連鎖反応」 . Journal of Cytology . 36 (2): 116– 117. doi : 10.4103/JOC.JOC_110_18 . PMC 6425773. PMID 30992648 .  
  3. ^シュリヴァスタヴァ、アキレシュワル・クマール;カンナウジヤ、ヴィノッド・クマール。シン、ラジェシュ・クマール。シン、ディヴィヤ編。 （2021年）。抗がん分子の供給源としての進化的多様性。土井: 10.1016/C2019-0-03285-2。ISBN 978-0-12-821710-8。
  4. ^デハスク、マリアンヌ;ペチュネロヴァ、パトリシア。ケンペ・ラガーホルム、ヴェンデラ。エリック・エルスマルク。ダニロフ、グレブ K.モーテンセン、ピーター。バルタニャン、セルゲイ。ダレン、愛（2022年4月13日）。「古代 DNA のシリカカラムベースの抽出プロトコルの開発と最適化」。遺伝子。13 (4): 687.土井: 10.3390/genes13040687。PMC 9032354。PMID 35456493。  
  5. ^ Yoshikawa H, Dogruman-Al F, Dogruman-Ai F, Turk S, Kustimur S, Balaban N, Sultan N (2011年10月). 「糞便サンプルからのヒトBlastocystis亜型の分子診断のためのDNA抽出キットの評価」.寄生虫学研究. 109 (4): 1045–50 . doi : 10.1007/s00436-011-2342-3 . PMID 21499752. S2CID 37191780 .  
  6. ^ Fahle, Gary A.; Fischer, Steven H. (2000年10月). 「スパイクされたヒト検体からのサイトメガロウイルスDNA回収における6種類の市販DNA抽出キットの比較」 . Journal of Clinical Microbiology . 38 (10): 3860– 3863. doi : 10.1128/JCM.38.10.3860-3863.2000 . PMC 87494. PMID 11015421 .  
  7. ^ Rice, George (2006年12月8日). 「DNA抽出」 .カールトン大学科学教育リソースセンター. 2022年10月9日閲覧。
  8. ^ 「フェノール・クロロホルムDNA抽出キット」。GeneQuick社製DNA抽出キット。2025年9月24日閲覧。
  9. ^ Rana, Ajay K (2025年8月). 「DNA抽出における困難な生物学的サンプルと戦略」. Journal of Investigative Medicine . 73 (6): 443– 459. doi : 10.1177/10815589251327503 . PMID 40033560 . 
  10. ^ a b cエルキンス、ケリー・M. (2013). 「DNA抽出」.法医学DNA生物学. pp.  39– 52. doi : 10.1016/B978-0-12-394585-3.00004-3 . ISBN 978-0-12-394585-3。
  11. ^ a b c dバトラー、ジョン・M (2005). 『法医学的DNAタイピング：STRマーカーの生物学、技術、遺伝学』（第2版）アムステルダム：エルゼビア・アカデミック・プレス. ISBN 978-0-08-047061-0. OCLC  123448124 .
  12. ^ Marmur, J. (1961). 「微生物からのデオキシリボ核酸の単離法」. Journal of Molecular Biology . 3 (2): 208–IN1. doi : 10.1016/S0022-2836(61)80047-8 .
  13. ^ Salvà Serra, Francisco; Salvà-Serra, Francisco; Svensson-Stadler, Liselott; Busquets, Antonio; Jaén-Luchoro, Daniel; Karlsson, Roger; RB Moore, Edward; Gomila, Margarita (2018年8月9日). 「ゲノムシーケンシングに適用可能な高品質かつ高収量の細菌DNAの抽出・精製プロトコル：Marmur法の改良版」プロトコル交換. doi : 10.1038/protex.2018.084 .
  14. ^ Li, Richard (2025).法医学生物学. doi : 10.4324/9781003562726 . ISBN 978-1-003-56272-6。
  15. ^ Pääbo S (1989年3月). 「古代DNA：抽出、特性評価、分子クローニング、酵素増幅」 .米国科学アカデミー紀要. 86 (6 ) : 1939–43 . Bibcode : 1989PNAS...86.1939P . doi : 10.1073/pnas.86.6.1939 . PMC 286820. PMID 2928314 .  
  16. ^ Li, Zhigang; Parris, Stephen; Saski, Christopher A. (2020). 「単分子技術に適したシンプルな植物高分子量DNA抽出法」 . Plant Methods . 16 (1): 38. Bibcode : 2020PlMet..16...38L . doi : 10.1186/ s13007-020-00579-4 . PMC 7071634. PMID 32190102 .   テキストはこのソースからコピーされたもので、Creative Commons Attribution 4.0 International Licenseに基づいて利用可能です。
  17. ^ Coudy, Delphine; Colotte, Marthe; Luis, Aurélie; Tuffet, Sophie; Bonnet, Jacques (2021年11月11日). 「常温におけるDNAの長期保存。DNAデータ保存への影響」 . PLOS ONE . 16 (11) e0259868. Bibcode : 2021PLoSO..1659868C . doi : 10.1371/ journal.pone.0259868 . PMC 8585539. PMID 34763344 .  
  18. ^ a b Johannesen, Jes; Fabritzek, Armin G.; Ebner, Bettina; Bikar, Sven-Ernö (2017年8月14日). 「Miseqデータおよびgenotyping-by-sequencingデータを用いたUrophora cardui（ミバエ科）の傍寄生個体群におけるマイクロサテライトマーカーおよびSNPマーカーの特性評価」 . PeerJ . 5 e3582. doi : 10.7717 / peerj.3582 . PMC 5560233. PMID 28828237 .  
  19. ^ Fuchs, Florence (2002年11月). 「バイオテクノロジー由来ワクチンの品質管理：技術的および規制上の考慮事項」. Biochimie . 84 (11): 1173– 1179. doi : 10.1016/s0300-9084(02)00028-7 . PMID 12595146 . 
  20. ^ Paszkiewicz, Konrad H.; Farbos, Audrey; O'Neill, Paul; Moore , Karen (2014). 「最先端における品質管理」 . Frontiers in Genetics . 5 : 157. doi : 10.3389/fgene.2014.00157 . PMC 4033843. PMID 24904650 .  

さらに読む

  • サムブルック, マイケル・R.; グリーン, ジョセフ (2012). 『分子クローニング』（第4版）. コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク州: コールド・スプリング・ハーバー研究所出版. ISBN 1936113422. OCLC 774021237 . 
「 https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=DNA_extraction&oldid=1313705652」より取得