タンパク質スプライシング
インテインが関与するタンパク質スプライシングのメカニズム
インテインが関与するタンパク質スプライシングのメカニズム。この図では、Nエクステインは赤、インテインは黒、Cエクステインは青で示されています。Xは酸素原子または硫黄原子を表します。

タンパク質スプライシングは、特定のタンパク質の分子内反応であり、内部タンパク質セグメント（インテインと呼ばれる）が前駆体タンパク質から除去され、その両側のC 末端およびN 末端外部タンパク質（エクステインと呼ばれる）が連結される。前駆体タンパク質のスプライシング部位は主にシステインまたはセリンであり、これらは求核性側鎖を含むアミノ酸である。現在知られているタンパク質スプライシング反応は、アデノシン三リン酸（ATP）やグアノシン三リン酸（GTP）などの外因性補因子やエネルギー源を必要としない。通常、スプライシングはpre-mRNA スプライシングにのみ関連している。この前駆体タンパク質は、N エクステイン、それに続くインテイン、そしてC エクステインの 3 つのセグメントを含む。スプライシングが行われると、結果として生じるタンパク質には C エクステインに連結された N エクステインが含まれ、このスプライシング産物もエクステインと呼ばれる。

歴史

最初のインテインは1988年、アカパンカビ[ 1 ]とニンジン[ 2 ]の液胞ATPase（インテインなし）と、酵母の相同遺伝子（インテインあり）との配列比較によって発見されました。この相同遺伝子は、カルシウムイオントランスポーターとして初めて記載されました[ 3 ] 。 1990年、平田ら[ 4 ]は、酵母遺伝子の余分な配列がmRNAに転写され、翻訳後にのみ宿主タンパク質から除去されることを実証しました。それ以来、インテインは生命の3つのドメインすべて（真核生物、細菌、古細菌）とウイルスで発見されています。

タンパク質スプライシングは予期せぬ現象であり、そのメカニズムは1990年に2つのグループ（安楽[ 5 ]とスティーブンス[ 6 ] ）によって発見されました。彼らはともに、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）由来の液胞型H + -ATPase酵素の前駆体であるVMA1を発見しました。N末端およびC末端のアミノ酸配列は、他の生物由来の液胞型H + -ATPaseのDNA配列の70%に相当し、中央位置のアミノ酸配列は酵母HOヌクレアーゼの全DNA配列の30%に相当しました。

多くの遺伝子には、無関係なインテインをコードする領域が、異なる位置に挿入されている。こうした理由やその他の理由から、インテイン（あるいはより正確には、インテインをコードする遺伝子領域）は利己的遺伝要素と呼ばれることもあるが、寄生的遺伝要素と呼ぶ方が正確かもしれない。遺伝子中心進化論によれば、ほとんどの遺伝子は他の遺伝子や対立遺伝子と競合する点においてのみ「利己的」であり、通常は生物にとって何らかの機能を果たす。一方、「寄生的遺伝要素」は、少なくとも初期段階では、生物の適応度にプラスの影響を与えない。[ 7 ] [ 8 ]

2019年12月現在、UniProtKBデータベースには、数十アミノ酸残基から数千アミノ酸残基まで、手動でインテインとして注釈が付けられた188のエントリが含まれています。[ 9 ]最初のインテインは、サッカロミセス・セレビシエのVMA遺伝子内にコードされていることが発見されました。その後、真菌（子嚢菌、担子菌、接合菌、ツボカビ）やさまざまなタンパク質でも発見されました。既知のインテイン含有タンパク質とは遠縁であるが、後生動物のヘッジホッグタンパク質とは近縁のタンパク質が、グロメロ菌門由来のインテイン配列を持つことが報告されています。新たに報告されたインテインの多くにはホーミングエンドヌクレアーゼが含まれており、そのうちのいくつかは明らかに活性です。[ 10 ]真菌におけるインテインの量が多いことは、インテイン含有遺伝子の水平伝播を示しています。一方、真正細菌と古細菌には、現在289種類と182種類のインテインが知られています。当然のことながら、真正細菌と古細菌のインテインのほとんどは、真菌と同様に、核酸代謝タンパク質に挿入されていることが分かっています。[ 10 ]

インテインは非常に多様ですが、同じインテイン含有タンパク質の多くが多くの種に見られます。たとえば、スプライソソームに重要なプレ mRNA プロセッシング因子 8 (Prp8) タンパク質には、真核生物種全体で 7 つの異なるインテイン挿入部位があります。[ 11 ]インテインを含む Prp8 は真菌で最も一般的に見られますが、アメーボゾア、緑藻類、カプサスポラ、チョアノフラゲリダにも見られます。多くのマイコバクテリアは、 DnaB (細菌複製ヘリカーゼ)、RecA (細菌 DNA リコンビナーゼ)、SufB ( FeS クラスターアセンブリタンパク質) 内にインテインを持っています。[ 12 ] [ 13 ] DnaB インテインの構造と数は、マイコバクテリウム属内外で著しく異なります。興味深いことに、インテインを含む DnaB は藻類の葉緑体にも見られます。[ 14 ]古細菌に見られるインテイン含有タンパク質には、RadA（RecAホモログ）、RFC、PolB、RNRなどがある。[ 15 ]同じインテイン含有タンパク質（またはそのホモログ）の多くは、生命体の2つ、あるいは3つのドメインすべてに存在している。インテインは、バクテリオファージや真核生物ウイルスによってコードされるプロテオームにも見られる。ウイルスは、多様なインテイン含有生物にインテインを分配する媒介として関与していた可能性がある。[ 15 ]

機構

クラス 1 インテインのプロセスは、前駆体タンパク質のインテイン部分の最初の残基 (セリン、スレオニン、またはシステイン) の側鎖がすぐ上流の残基 (つまり、N エクステインの最後の残基) のペプチド結合を求核攻撃して線状エステル(またはチオエステル) 中間体を形成するときのNO または NS シフトで始まります。エステル交換は、C エクステインの最初の残基の側鎖が新しく形成された (チオ) エステルを攻撃してインテインのN 末端を解放するときに起こります。これにより、ペプチド結合を介してではないものの、N エクステインと C エクステインが結合した分岐中間体が形成されます。インテインの最後の残基は常にアスパラギン(Asn) であり、この側鎖のアミド窒素原子がインテインと C エクステイン間のペプチド結合を切断し、末端環状イミドを持つ自由インテインセグメントが生成されます。最後に、 Cエクステインの遊離アミノ基がNエクステインとCエクステインを結合している（チオ）エステルを攻撃する。ONまたはSNシフトによりペプチド結合が形成され、機能的な連結タンパク質が形成される。[ 16 ]

クラス2インテインには求核性の第一側鎖がなく、アラニンのみである。代わりに、反応は求核置換反応から直接開始され、Cエクステインの最初の残基がNエクステインの最後の残基のペプチドカルボキシル基を攻撃する。残りの反応は通常通り進行し、アスパラギン酸が環状イミドに変化する反応から始まる。[ 17 ]

クラス3インテインは求核性の第一側鎖を持たず、アラニンのみであるが、内部に非連続的な「WCT」モチーフを有する。内部のC（システイン）残基は、N-エクステインの最終残基のペプチドカルボキシル基を攻撃する（求核置換）。C-エクステインの最初の残基が新たに形成されたチオエステルを攻撃することでエステル交換反応が起こる。残りの反応は通常通り進行する。[ 18 ]

スプライシング効果のメカニズムは、ネイティブケミカルライゲーションと呼ばれる中型タンパク質を化学的に生成する技術と自然に類似しています。

インテイン

インテインはタンパク質の一部で、 タンパク質スプライシングの過程で自身を切り出し、残りの部分（エクステイン）とペプチド結合で結合することができる。 [ 19 ]インテインは（RNA）イントロンとの類推でタンパク質イントロンとも呼ばれる。

インテインスプライシングは翻訳後段階の自己触媒的プロセスで起こる。ここでは、エクステインを赤で、インテインを青で示している。

命名規則

インテインの名前の最初の部分は、それが存在する生物の学名に基づいており、2番目の部分は対応する遺伝子またはエクステインの名前に基づいています。例えば、 Thermoplasma acidophilumに存在し、液胞ATPaseサブユニットA（VMA）に関連するインテインは「Tac VMA」と呼ばれます。

通常、この例のように、生物を特定するには3文字だけで十分ですが、バリエーションがあります。例えば、株を示すために追加の文字が加えられることがあります。対応する遺伝子に複数のインテインがコードされている場合、各インテインには5 'から3 'まで、または識別順に番号が付けられます（例：「Msm dnaB-1」）。

インテインをコードする遺伝子セグメントは通常、インテインと同じ名称が付けられますが、混乱を避けるため、インテイン本体の名称は通常大文字（例：Pfu RIR1-1）で表記され、対応する遺伝子セグメントの名称はイタリック体（例：Pfu rir1-1）で表記されます。また、曖昧さを回避するための別の慣例として、タンパク質名の後に小文字の「i」を付ける方法もあります（例： Msm DnaBi1）。[ 20 ]

インテインの種類

インテインは多くの基準で分類できます。

  • インテインがどのように自己スプライシングを行うかに基づいて、シススプライシング（自己スプライシングを行う）とトランススプライシング（外部からの助けを必要とする）に分類されます。研究されているインテインのほとんどはシススプライシングです。スプリットインテイン（下記参照）は通常、2つの半分が互いに助け合うため、トランススプライシングです。[ 17 ]
  • エンドヌクレアーゼドメインの有無に基づいて分類されます。エンドヌクレアーゼドメインを有するものは「マキシインテイン」、そうでないものには「ミニインテイン」と呼ばれます。[ 17 ]
  • スプライシング機構に基づいて分類されますが、その機構は配列に基づいて部分的に[ 18 ]推測できます。クラス1インテインは最も研究されているタイプで、最初の残基がシステインまたはセリンです。クラス2インテイン、または「アラニンインテイン」は最初の残基がアラニンで、WCTモチーフはありません。クラス3インテインは最初の残基がアラニンで、不連続な「WCT」モチーフがあります。[ 17 ]また、セリンで始まり「WCT」モチーフを含むインテインもクラス3に分類されるべきであると提案されています。 [ 18 ]

フルインテインとミニインテイン

インテインには、スプライシングドメインに加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子（HEG）ドメインが含まれることがあります。このドメインは、相同染色体上のインテインを含まない対立遺伝子でDNAを切断することでインテインの拡散を担い、DNA二本鎖切断修復（DSBR）システムを活性化します。DSBRシステムは切断部位を修復し、インテインをコードするDNAを以前はインテインが含まれていなかった部位にコピーします。[ 17 ] HEGドメインはインテインスプライシングには必要ないため、失われて最小限のインテイン、つまりミニインテインが形成される可能性があります。いくつかの研究では、HEGドメインを追加または削除し、新しいコンストラクトの活性を測定することで、インテインのモジュール性が実証されています。

スプリットインテイン

前駆体タンパク質のインテインは、2つの遺伝子に由来する場合がある。この場合、インテインはスプリットインテインと呼ばれる。例えば、シアノバクテリアでは、DNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットαであるDnaEは、 dnaE-nとdnaE-cという2つの別々の遺伝子によってコードされている。dnaE -n産物はNエクステイン配列とそれに続く123アミノ酸のインテイン配列から構成され、dnaE-c産物は36アミノ酸のインテイン配列とそれに続くCエクステイン配列から構成される。[ 21 ]

バイオテクノロジーへの応用

インテインはタンパク質スプライシングにおいて非常に効率的であり、バイオテクノロジーにおいて重要な役割を果たしています。現在までに200種類以上のインテインが同定されており、そのサイズは100～800個のアミノ酸から構成されています。インテインは、タンパク質半合成[ 22 ]や、巨大タンパク質のNMR研究に有用なタンパク質セグメントの選択的標識[ 23 ]など、特定の用途向けに設計されています。

インテイン切除の薬剤による阻害は、医薬品開発に有用なツールとなる可能性があります。インテインが切除されなければ、その構造が破壊されるため、インテインを含むタンパク質は正常な機能を果たせません。

インテインは、ミトコンドリアゲノムに通常コードされている特定の高度に疎水性のタンパク質の同種異系発現、例えば遺伝子治療において有用であることが示唆されている[ 24 ]。これらのタンパク質の疎水性は、ミトコンドリアへの輸送を阻害する。したがって、非疎水性インテインを挿入することで、輸送が促進される可能性がある。輸送後にインテインを除去することで、タンパク質は野生型に戻る。

アフィニティータグは、不純物の少ない組み換えタンパク質の蓄積を可能にするため、組み換えタンパク質の精製に広く使用されている。しかし、アフィニティータグは、最終精製ステップでプロテアーゼによって除去する必要がある。余分なタンパク質分解ステップにより、組み換えタンパク質からアフィニティータグを除去する際のプロテアーゼ特異性の問題、および消化産物の除去の問題が発生する。この問題は、制御された環境下でアフィニティータグを自己切断型インテインに融合することで回避できる。この種の発現ベクターの第一世代では、改変したSaccharomyces cerevisiae VMA（Sce VMA）インテインが使用されていた。Chong et al. [ 25 ]は、 Bacillus circulansのキチン結合ドメイン（CBD）をアフィニティータグとして使用し、このタグを改変したSce VMAインテインと融合した。改変インテインは、低温、広いpH範囲において、1,4-ジチオトレイトール（DTT）、β-メルカプトエタノール（β-ME）、またはシスチンとのN末端ペプチド結合において自己切断反応を起こす。組換えタンパク質を発現させた後、細胞ホモジェネートをキチンを含むカラムに通す。これにより、キメラタンパク質のCBDがカラムに結合できる。さらに、温度が低下し、上記の分子がカラムを通過すると、キメラタンパク質は自己スプライシングを起こし、目的タンパク質のみが溶出される。この新規技術はタンパク質分解工程を必要とせず、改変Sce VMAはCBDを介してキチンに結合したままカラム内に留まる。[ 25 ]

最近、インテインは自己凝集ペプチドに基づくタンパク質精製に利用されています。エラスチン様ポリペプチド（ELP）はバイオテクノロジーにおいて有用なツールです。標的タンパク質と融合すると、細胞内で凝集体を形成する傾向があります。[ 26 ]これにより、タンパク質精製に必要なクロマトグラフィー工程が不要になります。インテインの融合タンパク質にはELPタグが使用されており、クロマトグラフィー（遠心分離）なしで凝集体を単離し、その後、インテインとタグを制御された方法で切断して標的タンパク質を溶液中に放出することができます。このタンパク質単離は連続培地フローを用いて行うことができ、大量のタンパク質が得られるため、従来の方法よりも経済的に効率的です。[ 26 ]別の研究グループは、標的タンパク質を単離するために、より小さな自己凝集タグを使用しました。小さな両親媒性ペプチド18AとELK16（図5）を用いて、自己切断凝集タンパク質を形成しました。[ 27 ]

抗菌剤開発への応用

過去 20 年間で、抗菌用途へのインテインの利用に対する関心が高まっています。[ 12 ]インテインスプライシングは単細胞生物にのみ見られ、特に病原性微生物に多く見られます。[ 28 ]さらに、インテインはハウスキーピングタンパク質やヒト宿主内での生物の生存に関与するタンパク質内によく見られます。翻訳後のインテイン除去は、タンパク質が適切に折り畳まれて機能するために必要です。例えば、Gaëlle Huetらは、 Mycobacterium tuberculosisにおいて、スプライスされていない SufB が SUF 機構の構成要素である SufBCD 複合体の形成を妨げることを実証しました。[ 29 ]そのため、インテインスプライシングの阻害は、抗菌剤開発の強力なプラットフォームとして機能する可能性があります。

インテインスプライシング阻害剤に関する現在の研究は、抗結核剤（結核菌は3つのインテイン含有タンパク質を持っている）や、病原性真菌であるクリプトコッカスやアスペルギルスに有効な薬剤の開発に重点を置いている。[ 13 ]シスプラチンや類似の白金含有化合物は、触媒残基に配位することにより、結核菌RecAインテインのスプライシングを阻害する。[ 30 ]銅(II)イオンや亜鉛(II)イオンなどの二価カチオンも同様に機能して、スプライシングを可逆的に阻害する。[ 12 ]しかし、これらの方法はどちらも現在のところ効果的で安全な抗生物質には適していない。真菌Prp8インテインも、触媒Cys1残基に干渉することにより、二価カチオンとシスプラチンによって阻害される。 [ 12 ] 2021年、Liらは、真菌Prp8インテインが、触媒Cys1残基に干渉することにより、二価カチオンとシスプラチンによって阻害されるという新しい知見を発表した。 Prp8インテインスプライシングの小分子阻害剤がC. neoformansとC. gattiiの増殖を遅らせるのに選択的かつ効果的であることを示し、インテインスプライシング阻害剤の抗菌性の可能性に関する刺激的な証拠を提供した。[ 31 ]

参照

参考文献

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