蛍光in situハイブリダイゼーション
ViewRNA FISHアッセイを用いた細胞内のマルチプレックスRNA可視化
FISH法を用いてbcr/abl転座（慢性骨髄性白血病に関連する）が陽性であった中期細胞。染​​色体は青色で示されている。緑と赤の斑点で標識された染色体（左上）が転座を有する染色体である。

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、核酸配列の特定の部分に高い相補性で結合する蛍光プローブを用いる分子細胞遺伝学的手法である。1980年代初頭に生物医学研究者によって開発され[ 1 ] 、染色体上の特定のDNA配列の有無を検出し、その位置を特定することを目的としている。蛍光顕微鏡を用いることで、蛍光プローブが染色体のどこに結合しているかを特定することができる。FISHは、遺伝カウンセリング、医療、種の同定などにおいて、DNAの特定の特徴を見つけるためによく用いられる。[ 2 ]

FISHは、細胞、循環腫瘍細胞、組織サンプル中の特定のRNA標的（ mRNA、lncRNA、miRNA）[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]の検出と局在化にも使用できます。この文脈において、FISHは細胞および組織内における遺伝子発現の空間的および時間的パターンを定義するのに役立ちます。

プローブ – RNAとDNA

C2C12分化細胞におけるmiR-133（緑）とミオジェニンmRNA（赤）の検出

生物学において、プローブとは、対象となるヌクレオチド配列に相補的な DNA または RNA の一本鎖のことです。

RNAプローブは、組織や細胞内のmRNA、[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] lncRNA [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]およびmiRNAを視覚化するために、任意の遺伝子または遺伝子内の任意の配列用に設計できます。 FISHは、細胞の再生サイクル、特に核の間期で染色体異常を調べるために使用されます。[ 12 ] FISHでは、類似の染色体を引き付ける人工染色体基盤を持つプローブを作成することにより、アーカイブの大規模な一連のケースを分析して、特定された染色体をより簡単に識別できます。[ 12 ]核異常が検出されると、各プローブのハイブリダイゼーション信号が発せられます。[ 12 ] mRNAとlncRNAを検出するための各プローブは、約20〜50のオリゴヌクレオチドペアで構成され、各ペアは40〜50 bpのスペースをカバーします。詳細は、使用する特定のFISH技術によって異なります。 miRNA 検出の場合、プローブは miRNA を特異的に検出するための独自の化学反応を使用し、miRNA 配列全体をカバーします。

4つの異なるプローブで標識された尿路上皮細胞

プローブは多くの場合、ヒトゲノム プロジェクトで使用するために分離、精製、増幅された DNA 断片から作られます。ヒトゲノムのサイズは、直接配列決定できる長さに比べて非常に大きいため、ゲノムを断片に分割する必要がありました。(最終的な分析では、配列特異的エンドヌクレアーゼを使用して各断片のコピーをさらに小さな断片に消化し、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して各小さな断片のサイズを測定し、その情報を使用して大きな断片が互いに重なり合っている場所を決定することで、これらの断片は整理されました。) 断片を個々の DNA 配列と共に保存するために、断片は継続的に複製される細菌集団のシステムに追加されました。各集団が単一の人工染色体を維持している細菌のクローン集団は、世界中のさまざまな研究室に保管されています。人工染色体 ( BAC ) は、ライブラリを備えたどの研究室でも、増殖、抽出、ラベル付けすることができます。ゲノムライブラリは、開発された機関にちなんで名付けられることがよくあります。一例として、ニューヨーク州バッファローにあるロズウェルパーク総合がんセンター（旧称ロズウェルパークがん研究所）にちなんで名付けられたRPCI-11ライブラリが挙げられます。これらの断片は約10万塩基対で、ほとんどのFISHプローブの基礎となっています。

調製とハイブリダイゼーションプロセス – RNA

RNA FISHを使用する目的は、細胞、組織切片、さらには全マウント中の標的mRNA転写産物を検出することです。[ 13 ]このプロセスは、組織調製（プレハイブリダイゼーション）、ハイブリダイゼーション、および洗浄（ポストハイブリダイゼーション）の3つの主要な手順で行われます。

組織の準備は、RNA FISHを行うための適切な組織切片を採取することから始まります。まず、細胞、循環腫瘍細胞（CTC）、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）、または凍結組織切片を「固定」します。固定には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4%ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド（PFA）などの化学固定液を用いて生細胞を処理します。 [ 13 ]この固定処理は、細胞膜の透過処理（[ 14] ）を行う前に、細胞の構造的完全性を本質的に「保持」します。[ 14 ]透過処理は通常、トリトンXなどの界面活性剤を用いて行われます。死細胞はもはや機能的な膜を持たないため、トリトンXは細胞染色に適しています。[ 15 ]細胞透過処理は、70%エタノール溶液を用いて一晩冷蔵することでも行うことができます。[ 15 ]しかし、FISHは固定されていない細胞でも成功しています。[ 16 ]固定後、サンプルはハイブリダイゼーション試薬の浸透を可能にするために透過処理されます。組織透過性を高めるために、Tween-20やTriton X-100などの界面活性剤を0.1%濃度で使用することが一般的に行われています。[ 17 ]

ハイブリダイゼーションプロセスにおいて、温度、pH、塩濃度、ハイブリダイゼーション反応時間など、すべての最適条件が満たされていることが、in situで良好な結果を得るために不可欠です。必要な条件をすべて確認した後、まず20個のオリゴヌクレオチドペアからなる標的特異的プローブを標的RNAにハイブリダイズさせることで、ハイブリダイゼーションステップを開始します。別個でありながら互換性のあるシグナル増幅システムを使用することで、マルチプレックスアッセイ（アッセイごとに最大2つの標的）が可能です。シグナル増幅は、一連の連続ハイブリダイゼーションステップによって達成されます。[ 18 ]

ハイブリダイゼーション工程の後、洗浄工程が行われます。これらの工程は、非特異的なハイブリッドを除去し、サンプルに結合していないプローブ分子を除去してバックグラウンドシグナルを低減することを目的としています。組織または細胞における自己蛍光を低減するため、この段階では通常、エタノール洗浄が用いられます。[ 19 ]アッセイ終了時に、組織サンプルは共焦点蛍光顕微鏡やKeyence顕微鏡などの蛍光顕微鏡で観察されます。[ 17 ]

準備とハイブリダイゼーションプロセス – DNA

核内の遺伝子の位置を特定する FISH 実験の原理の概略図。

まず、プローブを構築します。プローブは、標的と特異的にハイブリダイズできる大きさである必要がありますが、ハイブリダイゼーションのプロセスを阻害するほど大きくあってはなりません。プローブは、蛍光色素、抗体の標的、またはビオチンで直接タグ付けされます。タグ付けは、ニックトランスレーションや、タグ付けされたヌクレオチドを用いた ポリメラーゼ連鎖反応など、様々な方法で行うことができます。

次に、間期または中期染色体標本を作成します。染色体は基質（通常はガラス）にしっかりと接着しています。反復DNA配列は、短いDNA断片を試料に加えることでブロックする必要があります。次に、プローブを染色体DNAに添加し、ハイブリダイゼーションさせながら約12時間インキュベートします。数回の洗浄工程で、ハイブリダイズしていない、または部分的にハイブリダイズしたプローブをすべて除去します。その後、染色体を励起し、画像を記録できる顕微鏡を用いて、結果を視覚化し、定量化します。

蛍光シグナルが弱い場合、顕微鏡の検出閾値を超えるためにはシグナルの増幅が必要になる場合があります。蛍光シグナルの強度は、プローブの標識効率、プローブの種類、色素の種類など、多くの要因に依存します。蛍光標識された抗体またはストレプトアビジンは色素分子に結合します。これらの二次成分は、強いシグナルを発するように選択されます。

プローブと分析のバリエーション

FISHは非常に一般的な手法です。様々なFISH手法の違いは、通常、プローブの配列と標識、そしてそれらの組み合わせ方の違いによるものです。プローブは、細胞性プローブと非細胞性プローブの2つの一般的なカテゴリーに分類されます。蛍光「in situ」ハイブリダイゼーションとは、プローブの細胞内配置を指します。

プローブのサイズは重要です。短いプローブは長いプローブよりもハイブリダイズ特異性が低いためです。そのため、標的配列に相補的なDNAまたはRNA鎖（通常10～25ヌクレオチド）が標的の探索によく使用されます。オーバーラップは検出可能な特徴の解像度を決定します。例えば、転座の切断点を検出することが実験の目的である場合、プローブのオーバーラップ（1つのDNA配列が隣接するプローブにどの程度含まれるか）が、切断点を検出できる最小範囲を決定します。

プローブ配列の混合比によって、プローブが検出できる特徴の種類が決まります。染色体全体にわたってハイブリダイズするプローブは、特定の染色体の数を数えたり、転座を示したり、染色体外のクロマチン断片を識別したりするために使用されます。これはしばしば「全染色体ペインティング」と呼ばれます。考えられるすべてのプローブを使用すると、すべての染色体（ゲノム全体）が蛍光標識されることになり、個々の配列の特徴を決定するのに特に有用ではありません。しかし、DNAの特定の領域（遺伝子座）に特異的な小さなプローブの混合物を作成することは可能です。これらの混合物は、欠失変異の検出に使用されます。特定の色と組み合わせると、遺伝子座特異的なプローブ混合物は、非常に特異的な転座の検出に使用されます。染色体の数を計算するために、特別な遺伝子座特異的プローブ混合物がよく使用されます。これらのプローブ混合物は、染色体のセントロメア領域に結合して、各染色体を識別するのに十分な特徴を持っています (染色体13、14、21、22を除く)。

他にも様々な手法で、異なる色のプローブの混合物が用いられます。蛍光色素の混合物には様々な色が含まれているため、染色体全体のプローブ混合物と様々な色の比率を用いることで、各ヒト染色体を特徴的な色で識別することができます。染色体の数は容易に識別できる蛍光色素の色の数よりも多くありますが、プローブ混合物の比率を用いて二次色を作り出すことができます。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ CGH ）と同様に、二次色のプローブ混合物は、同じ染色体に対して異なる色のプローブを2セット、適切な比率で混合することによって作成されます。この手法はM-FISHと呼ばれることもあります。

M-FISHで多様な色彩を可能にするのと同じ物理的性質が、転座の検出にも応用できます。つまり、隣接する色は重なり合って見え、二次色が観察されます。一部のアッセイでは、対象となる症例において二次色が現れたり現れなかったりするように設計されています。例えば、BCR/ABL転座の検出では、二次色が疾患を示します。このバリエーションは、しばしば二重融合FISHまたはD-FISHと呼ばれます。反対の状況、つまり二次色の不在が病理学的である場合は、片方の切断点のみが既知または一定である転座を調べるために使用されるアッセイで例証されます。切断点の片側ともう一方の正常な染色体に対して、遺伝子座特異的プローブが作成されます。正常な細胞では二次色が観察されますが、転座が発生すると一次色のみが観察されます。この手法は「ブレークアパートFISH」と呼ばれることもあります。

単一分子RNA FISH

単分子RNA FISH（Stellaris® RNA FISH [ 20 ]または smFISH [ 21 ]とも呼ばれる）は、組織サンプルの薄層中のmRNAやその他の長鎖RNA分子を検出・定量する方法です。標的は、複数の短い単標識オリゴヌクレオチドプローブを適用することで、確実に画像化できます。[ 22 ]最大48個の蛍光標識オリゴがmRNA分子1個に結合することで、広視野蛍光顕微鏡画像において各標的mRNAを正確に検出・局在させるのに十分な蛍光が得られます。目的の配列に結合しないプローブは、背景と区別できるほど十分に局在した蛍光を発しません。[ 23 ]

単分子RNA FISHアッセイは、シンプレックス法またはマルチプレックス法で実施でき、定量PCRのフォローアップ実験として使用したり、蛍光抗体アッセイと同時に画像化したりすることができます。この技術は、がん診断[ 24 ] 、神経科学、遺伝子発現解析[ 25 ]、コンパニオン診断への応用が期待されています。

繊維質の魚

間期または中期標本の代替技術であるファイバーFISHでは、間期染色体が、従来のFISHのようにきつくコイル状に巻かれたり、間期FISHのように染色体テリトリー構造をとったりするのではなく、直線状に引き伸ばされた状態でスライドに付着される。これは、スライドに固定して溶解した細胞、または精製DNA溶液に、スライドの長さに沿って機械的せん断を加えることで達成される。染色体コーミングと呼ばれる技術が、この目的でますます利用されている。染色体の伸びた構造により、数キロベースまでの解像度が劇的に向上する。ファイバーFISHサンプルの調製は、概念的には単純であるものの、かなり熟練した技術であり、専門の研究室のみが日常的にこの技術を使用している。[ 26 ]

Q-FISH

Q-FISHは、FISHとPNA、そしてコンピュータソフトウェアを組み合わせて蛍光強度を定量化する技術です。この技術はテロメア長の研究において日常的に用いられています。

フローフィッシュ

Flow-FISH はフローサイトメトリーを使用して、細胞ごとの蛍光測定により FISH を自動的に実行します。

マフィッシュ

マイクロ流体支援FISH（MA-FISH ）は、マイクロ流体の流れを利用してDNAハイブリダイゼーション効率を高め、高価なFISHプローブの消費量を削減し、ハイブリダイゼーション時間を短縮します。MA-FISHは、乳がん組織中のHER2遺伝子の検出に応用されています。 [ 27 ]

マーフィッシュ

マイクロオートラジオグラフィーFISHは、従来のFISHに放射性標識基質を組み合わせて、系統群と代謝活性を同時に検出する技術である。[ 28 ]

ハイブリッド融合-FISH

ハイブリッドフュージョンFISH（HF-FISH）は、蛍光色素分子の励起/発光を主成分として組み合わせ、動的光透過（DOT）と呼ばれる標識プロセスによって追加スペクトルを生成します。3種類の主蛍光色素分子は、DOTを用いたコンビナトリアル標識の結果、合計7種類の容易に検出可能な発光スペクトルを生成します。ハイブリッドフュージョンFISHは、臨床腫瘍学パネルを標的とした高度にマルチプレックス化されたFISHアプリケーションを可能にします。この技術は、従来の蛍光顕微鏡で容易に検出できる効率的なプローブセットにより、より迅速なスコアリングを実現します。

マーフィッシュ

マルチプレックスエラーロバスト蛍光in situハイブリダイゼーション[ 29 ]は、smFISHの高度にマルチプレックス化されたバージョンです。コンビナトリアルラベリング、続いてイメージング、そしてエラー耐性エンコーディング[ 29 ]を用いることで、多数のRNA分子と細胞内の空間的局在を捕捉します。多数のRNA分子を捕捉することで、遺伝子制御ネットワークの解明、アノテーションされていない遺伝子の機能予測、そして関連するタンパク質と相関するRNA分子の分布パターンの同定が可能になります。

ヒトデ

Starfishは、2019年に科学者コンソーシアムによって開発されたソフトウェアツールセットです。9種類のFISH法のバリエーションから得られるデータを解析するために開発されました。これは、すべてのバリエーションから得られるデータ（細胞内のx座標とy座標にマッピングされた遺伝子発現値）が同じであることに起因しています。バイオインフォマティクス研究者だけでなく、すべての科学者向けに開発されたこのソフトウェアは、画像セットを読み取り、ノイズを除去し、RNA分子を同定します。このアプローチは、単一細胞トランスクリプトミクス解析と同様に、FISHデータセットの標準的な解析スキームを定義することを目指しています。[ 30 ]

医療用途

発達障害のある子供を持つ親は、次の子供をもうける前に、子供の状態についてもっと知りたいと思うことがよくあります。こうした懸念は、親と子供の DNA を分析することで対処できます。子供の発達障害がわからない場合は、FISH 法や細胞遺伝学的手法を使用して原因を特定できる可能性があります。FISH 法を使用して診断される疾患の例には、プラダー・ウィリー症候群、アンジェルマン症候群、22q13 欠失症候群、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、泣きじゃくり、口蓋心臓顔面症候群、ダウン症候群などがあります。精子細胞の FISH 法は、異常な体細胞核型または減数分裂核型の男性、および乏精子症の男性に適応されます。乏精子症の男性の約 50% は精子染色体異常率が高いためです。[ 31 ] 21番染色体、X染色体、Y染色体の分析は、リスクのある乏精子症の個人を特定するのに十分である。[ 31 ]

医療において、FISH は、がんなどの病気の診断、予後評価、または寛解評価に使用できます。これにより、治療を個別に調整できます。 メタフェーズ染色体分析を含む従来の検査では、微妙な染色体特徴のために、ある病気と別の病気を区別する特徴を特定できないことがよくあります。 FISH ではこれらの違いを明らかにすることができます。また、FISH を使用すると、分裂細胞を必要とし、技術者がスライドを手動で準備して分析するという労力と時間を要する標準的な細胞遺伝学的方法よりも簡単に病気の細胞を検出できます。 一方、FISH は生細胞を必要とせず、コンピューターが存在する蛍光ドットをカウントして自動的に定量化できます。 ただし、曲がったりねじれたりしたメタフェーズ染色体のバンドパターンの微妙な違いを見分けるには、訓練を受けた技術者が必要です。 FISH は、ラボオンチップマイクロ流体デバイスに組み込むことができます。この技術はまだ開発段階ですが、他のラボオンチップ方式と同様に、よりポータブルな診断技術につながる可能性があります。[ 32 ] [ 33 ]

この図は、病原体同定に用いられる蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）のプロセスの概要を示しています。まず、患者から感染組織のサンプルを採取します。次に、疑わしい病原体の遺伝子コードに相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、蛍光プローブで化学的にタグ付けします。採取した組織サンプルは、蛍光タグ付きオリゴヌクレオチドが細胞膜を透過できるように化学的に処理する必要があります。組織サンプルを処理後、タグ付けされた相補的なオリゴヌクレオチドを添加します。蛍光タグ付きオリゴヌクレオチドは、疑わしい病原体の相補DNAにのみ結合します。組織サンプル中に病原体が存在する場合、タグ付きオリゴヌクレオチドで処理すると、病原体の細胞が蛍光を発します。他の細胞は処理後も蛍光を発しません。
細菌性病原体の同定に用いられる蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の一般的なプロセス。まず、患者から感染組織サンプルを採取します。次に、疑わしい病原体の遺伝子コードに相補的なオリゴヌクレオチドに蛍光プローブを化学的に標識します。組織サンプルは、蛍光標識オリゴヌクレオチドが細胞膜を透過できるように化学処理されます。次に蛍光タグが追加され、疑わしい病原体の相補DNAにのみ結合します。組織サンプル中に病原体が存在する場合、標識オリゴヌクレオチドで処理すると、病原体の細胞が蛍光を発します。他の細胞は蛍光を発しません。

種の識別

FISHは、医療微生物学の分野で病原体を特定するための診断技術として広く研究されてきました。[ 34 ]有用で応用可能な技術であることが証明されているにもかかわらず、診断研究室ではまだ広く適用されていません。診断までの時間が短い（2時間未満）ことは生化学的鑑別法に比べて大きな利点でしたが、この利点は、生化学的鑑別法に比べてより広範囲の病原体を同定できるMALDI-TOF-MSによって脅かされています。診断目的でのFISHの使用は、即時の種の同定が必要な場合、特に血液培養の調査においてその目的を見出しており、FISHは予備的な迅速診断のための安価で簡単な技術です。[ 34 ]

FISH法は、2つの生物種のゲノムを比較し、進化関係を推測するためにも用いられます。同様のハイブリダイゼーション法はズーブロット法と呼ばれます。細菌のFISHプローブは、 16S rRNA領域のプライマーであることが多いです。

FISH法は、微生物生態学の分野で微生物の同定に広く用いられています。例えば、バイオフィルムは、複雑な（多くの場合）複数種の細菌組織で構成されています。1種の細菌についてDNAプローブを調製し、このプローブを用いてFISH法を実施することで、バイオフィルム内における特定の細菌種の分布を可視化することができます。2種の細菌について（異なる2色の）プローブを調製することで、バイオフィルム内における2種の細菌種の共局在を可視化・研究することができ、バイオフィルムの微細構造を明らかにするのに役立ちます。

比較ゲノムハイブリダイゼーション

比較ゲノムハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション強度の比較と並行してFISHを使用し、核ゲノム内のDNA配列の複製プロセスにおける主要な破壊を思い出す方法として説明できます。[ 35 ]

仮想核型

バーチャルカリオタイピングは、FISHパネルに代わる費用対効果が高く、臨床的に利用可能なもう一つの代替法です。FISHパネルでは、単一のアレイ上に数千から数百万のプローブを配置し、ゲノム全体のコピー数変化をこれまでにない解像度で検出します。現在、この種の解析では染色体物質の増減のみが検出され、多くの種類の白血病やリンパ腫に見られる特徴的な異常である転座や逆位などの均衡型再編成は検出されません。

スペクトル核型

スペクトル核型分析は、染色体を色分けした画像です。スペクトル核型分析では、様々な種類のプローブを様々な形態で用いるFISH法を採用し、各染色体がメタフェーズ段階を通して標識されている様子を観察します。このタイプの核型分析は、特に染色体の配列を調べる際に用いられます。

染色体の進化

マウス11番染色体のDNAで染色されたヒト染色体。ヒト17番、5番、2番、7番、22番染色体、およびその他の染色体とのハイブリダイゼーションシグナルを示している。つまり、祖先の染色体が複数の断片に分裂し、それが現在でも多くのヒト染色体に見られる。[ 36 ]

FISHは染色体の進化を研究するために使用できます。近縁種は類似した染色体を持ちます。この相同性は遺伝子またはゲノム配列決定だけでなく、FISHによっても検出できます。たとえば、ヒトとチンパンジーの染色体は非常に類似しており、FISHはチンパンジーとヒトの共通祖先が2つの小さな染色体を持ち、ヒトの系統でこれらが融合して1つのヒト染色体になったことを証明できます。同様に、より遠縁の種は類似した染色体を持ちますが、遺伝的距離が増すにつれて染色体が切断され融合する傾向があり、その結果モザイク染色体になります。これはFISHによって印象的に証明できます（図を参照）。[ 36 ]

参照

  • FISH プロセスの別の概略図。
    FISH プロセスの別の概略図。
  • FISH の検査コストを 90% 削減したマイクロ流体チップ。
    FISH の検査コストを 90% 削減したマイクロ流体チップ。
  • デュアルラベル FISH 画像; ビフィドバクテリア Cy3、総細菌 FITC。
    デュアルラベル FISH 画像; ビフィドバクテリア Cy3、総細菌 FITC。
  • U-2 OS 細胞 (DAPI) 内の NEAT1 (Quasar 570) に対する単分子 FISH によって可視化されたパラスペックル。
    U-2 OS 細胞 (DAPI) 内の NEAT1 (Quasar 570) に対する単分子 FISH によって可視化されたパラスペックル。

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