フォーススペクトル顕微鏡

フォーススペクトル顕微鏡（FSM）は、細胞質内の集合的なランダム力を測定するために開発されたアクティブマイクロレオロジーの応用です。[ 1 ]大きな不活性流動トレーサーを生細胞に注入すると、細胞骨格メッシュ内に留まり、活性モータータンパク質からの反響によって振動します。これらのランダム力の大きさは、トレーサー粒子の振動周波数から推測できます。光学顕微鏡を用いてトレーサー粒子の変動を追跡することで、 細胞内分子輸送へのアクティブランダム力の寄与をブラウン運動の寄与から分離することができます

基本原理

FSMは、モータータンパク質によって生成される確率的な細胞内力を調べるために、ミン・グオとデイビッド・A・ワイツによって開発されました。 [ 1 ]細胞質は液体の空隙とはほど遠く、アクチンとミオシンの複雑な網目構造を持ち、細胞に構造的な支持を与えるだけでなく、小胞やミトコンドリアなどの細胞小器官を収容しています。[ 2 ]細胞質内の高分子の密集に関する最近の研究では、巨大分子の拡散のような動きがブラウン運動によるものと誤って考えられているのではないかという懸念が生じています。[ 3 ]むしろ、巨大分子が埋め込まれたアクチンフィラメントをランダムに引っ張るミオシンモータータンパク質が、細胞内で分子の拡散のような動きを引き起こしているのではないかと疑われています。[ 3 ] [ 4 ] Guo et al細胞内の粒子の動きが熱拡散によるものか、細胞骨格を揺さぶる非筋肉性ミオシン II などの活性モータータンパク質からの反響によるものかを見分けるためのアッセイを開発しました。

FSMは、細胞骨格のメッシュサイズ（>50 nm）よりも大きいポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされたトレーサー粒子を注入し、 [ 5 ]、アクチンフィラメントとミオシンモータータンパク質のネットワーク間に沈着させる。ミオシンモータータンパク質がアクチンフィラメントを引っ張って細胞活動を行うと、このアクチンの変動は必然的に隣接するPEG化粒子を振動させる。トレーサーの変動の大きさは、活動中のモータータンパク質の力の総和に比例する。したがって、トレーサーの振動変位を記録することで、FSMは活動中のモータータンパク質によって発揮される力の大きさを測定し、導出することができる。[ 1 ]

力測定

PEG化トレーサーの変動はミオシンの凝集体モーター力と結合しており、フックのバネに例えることができる。

F＝kx{\displaystyle F=kx}

ここで、振動変位を発生させるために加えられる力は、細胞内環境の有効バネ定数に比例する。振動中の変位は時間の空間関数であり、光学顕微鏡を用いて直接測定することができる。 [ 1 ]次に、フーリエ変換によって時間領域の情報を周波数領域にマッピングし、周波数の関数として有用な次元を導出する。 F{\displaystyle F}x{\displaystyle x}k{\displaystyle k}

⟨（F（v））2⟩＝⟨（K（v））2⟩∗⟨（x（v））2⟩{\displaystyle \langle \left(F(v)\right)^{2}\rangle =\langle \left(K(v)\right)^{2}\rangle *\langle \left(x(v)\right)^{2}\rangle }

ここで、、およびは、確率的な力を説明するために使用される平均力、弾性、および変位の二次形式である。 [ 1 ]時間平均二乗変位は、周波数領域から時間領域へのフーリエ変換によって取得できる。振動周波数の観点から見ると、力の周波数スペクトルが高いほど、細胞の代謝活動が大きい。[ 6 ] 独立したマイクロメカニカル測定によって細胞質の弾性を計算できる。光ピンセットを使用してトレーサー粒子に所定の力を加えることで、FSMは結果として生じる変位を測定し、弾性バネ定数を推定することができる。[ 7 ] [ 8 ]⟨（F（v））2⟩{\displaystyle \langle \left(F(v)\right)^{2}\rangle }⟨（K（v））2⟩{\displaystyle \langle \left(K(v)\right)^{2}\rangle }⟨（x（v））2⟩{\displaystyle \langle \left(x(v)\right)^{2}\rangle }MSD＝⟨（X（t））2⟩{\displaystyle MSD=\langle \left(X(t)\right)^{2}\rangle }

応用

細胞質流動性

光ピンセットを用いたトレーサー粒子の指向性振動は、加えられた力とほぼ同期した変位をもたらし、細胞質が物質的に弾性固体に近いことを示唆しています。[ 1 ]これは、細胞質は大きな分子が自由に拡散できる粘弾性流体であるという以前の仮説とは全く対照的です。[ 9 ] ATPが枯渇した細胞 では、非筋ミオシンIIが不活性化されており、FSM実験により、トレーサー粒子は細胞質が固化したかのように振動を停止することが明らかになっています。[ 1 ]ミオシンIIは、ATP加水分解を介してアクチンフィラメントに結合して引っ張るモータータンパク質です。[ 10 ]これは、栄養飢餓状態の細菌では細胞質がガラス状の物質に変化するという発見をさらに裏付けています[ 11 ]このように、モータータンパク質によるATP加水分解は細胞質の流動性を維持するために重要であり、これは小胞輸送と細胞骨格における拡散運動に極めて重要であると考えられる。[ 1 ]

悪性癌の鑑別診断

FSMは細胞内の一般的な活動状態を測定することで、悪性癌細胞を特定するために適用できます。悪性癌細胞は、特徴的に弾性が高く[ 12 ]、運動性が高いです。悪性MCF-7乳癌細胞と良性MCF-10A乳癌細胞に対するFSM測定では、力のスペクトルに統計的に有意な分離が見られ、FSMによる転移癌の検査が可能になりました。[ 1 ] 細胞外環境の次元性は、癌細胞のFSM測定に大きな影響を与えます。3Dマトリックスでは、転移性乳癌細胞MDA-MB-231は、 2Dプレートで培養された細胞よりも比較的固体の細胞質が多く見られました。[ 13 ]

参考文献

  1. ^ a b c d e f g h i Guo, Ming; Ehrlicher, Allen J.; Jensen, Mikkel H.; Renz, Malte; Moore, Jeffrey R.; Goldman, Robert D.; Lippincott-Schwartz, Jennifer; Mackintosh, Frederick C.; Weitz, David A. (2014年8月14日). 「フォーススペクトル顕微鏡を用いた細胞質の確率的モーター駆動特性の探究」. Cell . 158 ( 4 ): 822–832 . doi : 10.1016/j.cell.2014.06.051 . PMC  4183065. PMID 25126787 
  2. ^ Brangwynne, CP; Koenderink, GH ; Mackintosh, FC; Weitz, DA (2007). 「細胞質拡散：分子モーターが細胞内を駆け巡る」（PDF） . Journal of Cell Biology . 183 (4): 583– 587. doi : 10.1083/jcb.200806149 . PMC 2582900. PMID 19001127 .  
  3. ^ a b MacKintosh, FC (2012). 「能動拡散：染色体遺伝子座の不規則なダンス」 . Proceedings of the National Academy of Sciences, USA . 109 (19): 7138– 7139. Bibcode : 2012PNAS..109.7138M . doi : 10.1073 / pnas.1204794109 . PMC 3358833. PMID 22562796 .  
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  9. ^ Guigas, G; Kalla, C; Weiss, M (2007). 「哺乳類細胞の細胞質と核質における高分子の密集度は保存されている」. FEBS Letters . 581 (26): 5094– 5098. doi : 10.1016/j.febslet.2007.09.054 . PMID 17923125. S2CID 29844974 .  
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  11. ^ Parry, BR; Surovtsev, IV; cabeen, MT; Corey, SO; Dufresne, ER; Jacobs-Wagner, C (2013). 「細菌の細胞質はガラスのような性質を持ち、代謝活動によって流動化する」 . Cell . 156 ( 1– 2 ): 183– 194. doi : 10.1016/j.cell.2013.11.028 . PMC 3956598. PMID 24361104 .  
  12. ^ Plodinec, M; et al. (2013). 「乳がんのナノメカニカルシグネチャー」 . Biophysical Journal . 104 (2): 321. Bibcode : 2013BpJ...104..321P . doi : 10.1016/j.bpj.2012.11.1779 .
  13. ^ Mak, M; Kamm, RD; Zaman, MH (2014). 「次元性とネットワークの破壊が3D環境における癌細胞のマイクロレオロジーに与える影響」 . PLOS Computational Biology . 10 (11) e1003959. Bibcode : 2014PLSCB..10E3959M . doi : 10.1371/journal.pcbi.1003959 . PMC 4238946. PMID 25412385 .  
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