遺伝子組み換え
この画像では、ある細菌細胞の遺伝子が別の細菌細胞に移動しています。この、2つ目の細菌細胞が新しい遺伝物質を取り込むプロセスは、形質転換と呼ばれます。

分子生物学および遺伝学において、形質転換とは、細胞膜を介して周囲の外因性遺伝物質が直接取り込まれ、細胞に組み込まれることによって生じる細胞の遺伝的変化である。形質転換が起こるためには、受容細菌がコンピテンス状態にある必要がある。これは自然界では飢餓や細胞密度といった環境条件に対する時間制限のある反応として起こる場合があり、実験室でも誘導されることがある。[ 1 ]

形質転換は、外来性の遺伝物質が細菌から別の細菌に渡される水平遺伝子伝達につながる3つのプロセスのうちの1つであり、他の2つは接合（直接接触する2つの細菌細​​胞間での遺伝物質の移動）と形質導入（バクテリオファージウイルスによる外来DNAの宿主細菌への注入）である。[ 1 ]形質転換では、遺伝物質は介在培地を通過し、その取り込みは完全に受容細菌に依存する。[ 1 ]

2014年時点で、形質転換能を持つ細菌は約80種知られており、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌がほぼ均等に分かれている。しかし、報告のいくつかは単一の論文によって裏付けられているため、この数は過大評価されている可能性がある。[ 1 ]

「形質転換」は、動物細胞や植物細胞を含む細菌以外の細胞への新しい遺伝物質の挿入を指すこともあります。しかし、「形質転換」は動物細胞に関しては癌状態への進行を示す特別な意味を持つため、このプロセスは通常「トランスフェクション」と呼ばれます。[ 2 ]

歴史

細菌の形質転換は、1928年にイギリスの細菌学者フレデリック・グリフィスによって初めて実証されました。[ 3 ]グリフィスは、加熱殺菌した細菌を注射することでマウスに肺炎のワクチン接種ができるかどうかに関心を持っていました。しかし、彼は肺炎球菌の非毒性株が、加熱殺菌した毒性株にさらされると毒性を持つようになることを発見しました。グリフィスは、加熱殺菌株の何らかの「形質転換原理」が、無害な株を毒性にする原因であると仮説を立てました。1944年、この「形質転換原理」はオズワルド・エイブリー、コリン・マクラウド、マクリン・マッカーティによって遺伝的なものであると特定されました。彼らは肺炎球菌の毒性株からDNAを単離し、このDNAだけを使って無害な株を毒性にすることができました。彼らは、細菌によるこのDNAの取り込みと組み込みを「形質転換」と呼んだ（エイブリー・マクラウド・マッカーティの実験を参照）[ 4 ] 。エイブリーらの実験結果は、当初科学界から懐疑的に受け止められたが、遺伝子マーカーの開発とジョシュア・レーダーバーグによる遺伝子伝達の他の方法（1947年の接合と1953年の形質導入）の発見によって、エイブリーの実験は受け入れられた。[ 5 ]

実験室で広く利用されている大腸菌は、当初は形質転換に不耐性であると考えられていました。しかし、1970年にモートン・マンデルと比嘉明子は、塩化カルシウム溶液で処理することで、大腸菌がヘルパーファージを使用せずにバクテリオファージλからDNAを取り込むことができることを示しました。[ 6 ] 2年後の1972年、スタンレー・ノーマン・コーエン、アニー・チャン、レスリー・スーは、CaCl2この処理はプラスミドDNAの形質転換にも効果的である。[ 7 ]マンデルと比嘉による形質転換法は後にダグラス・ハナハンによって改良された。[ 8 ]大腸菌における人工的に誘導されたコンピテンスの発見は、細菌の形質転換のための効率的かつ簡便な手順を生み出し、バイオテクノロジーと研究においてより簡単な分子クローニング法を可能にし、現在では日常的に使用されている実験室手順となっている。

1980年代後半には電気穿孔法が開発され、in vitro形質転換の効率が向上し、形質転換できる細菌株の数が増えました。 [ 9 ]動物細胞や植物細胞の形質転換も研究され、1982年にはラットの成長ホルモンの遺伝子をマウスの胚に注入して最初のトランスジェニックマウスが作られました。 [ 10 ] 1897年には植物の腫瘍を引き起こす細菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが発見され、1970年代初頭には腫瘍誘発因子はTiプラスミドと呼ばれるDNAプラスミドであることがわかりました。[ 11 ]腫瘍を引き起こすプラスミドの遺伝子を除去し、新しい遺伝子を追加することで、研究者は植物にA.ツメファシエンスを感染させ、細菌が選択したDNAを植物のゲノムに挿入することができました。[ 12 ]すべての植物細胞がA. tumefaciensに感染するわけではないため、電気穿孔法やマイクロインジェクション法などの他の方法が開発されました。[ 13 ]粒子照射法は、 1980年代にジョン・サンフォードが遺伝子銃（バイオリスティック粒子送達システム）を発明したことで可能になりました。 [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]

定義

形質転換は、自然界の細菌間で起こる3つの水平遺伝子伝達の形態の1つであり、ある形質をコードするDNAが1つの細菌から別の細菌に渡され、相同組換えによって受容体のゲノムに組み込まれます。他の2つは、バクテリオファージによって行われる形質導入と、細菌間の直接接触によって遺伝子が渡される接合です。[ 1 ]形質転換では、遺伝物質が介在培地を通過し、その取り込みは受容体の細菌に完全に依存します。[ 1 ]

コンピテンスとは、環境から外来DNAを取り込むことができる一時的な状態を指し、実験室で誘発されることもあります。[ 1 ]

これは共通の原核生物の祖先から受け継がれた古代のプロセスであり、DNA損傷、特にストレス条件下で生じた損傷の組換え修復を促進するための有益な適応であると考えられます。自然な遺伝子形質転換は、DNA損傷の修復のための適応であり、遺伝的多様性も生み出すと考えられます。[ 1 ] [ 17 ]

形質転換は、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ、髄膜炎菌、淋菌、インフルエンザ菌、コレラ菌などの医学的に重要なグラム陰性細菌種で研究されてきました。[ 18 ]また、シュードモナス・スタッツェリ、アシネトバクター・ベイリーなどの土壌中に生息するグラム陰性菌種や、ラルストニア・ソラナセアルムやキシレラ・ファスティディオーサなどのグラム陰性植物病原菌 でも研究されてきました。[ 18 ]グラム陽性細菌の形質転換は、医療上重要な肺炎球菌、ミュータンス菌、黄色ブドウ球菌、サンギニス菌、およびグラム陽性土壌細菌の枯草菌で研究されてきました。[ 17 ]また、いくつかの異なる綱に分布する少なくとも30種のシュードモナス亜綱でも報告されています。 [ 19 ]形質転換に関して最も研究されているシュードモナス亜綱は、医療上重要なヒト病原体である淋菌、インフルエンザ菌、およびヘリコバクター・ピロリです。[ 17 ]

「形質転換」は、動物細胞や植物細胞を含む細菌以外の細胞への新しい遺伝物質の挿入を指すこともあります。しかし、「形質転換」は動物細胞に関しては癌状態への進行を示す特別な意味を持つため、このプロセスは通常「トランスフェクション」と呼ばれます。[ 2 ]

自然な能力と変革

天然にコンピテントな細菌は、DNAを細胞膜を越えて輸送するためのタンパク質機構を提供する遺伝子セットを保有している。外来DNAを細胞内に輸送するには、IV型ピリとII型分泌システム、そして細胞膜におけるDNAトランスロカーゼ複合体の組み立てに関与するタンパク質が必要となる可能性がある。[ 20 ]

グラム陽性菌とグラム陰性菌では細胞膜の構造が異なるため、これらの細胞における DNA の取り込みのメカニズムに若干の相違があるが、ほとんどの細胞は関連タンパク質が関与する共通の特徴を共有している。DNA はまず DNA 受容体上のコンピテント細胞表面に結合し、 DNA トランスロカーゼを介して細胞質膜を通過する。[ 21 ]通過できるのは一本鎖 DNA のみで、もう一方の鎖はその過程でヌクレアーゼによって分解される。通過した一本鎖 DNA は、RecA依存性のプロセスによって細菌の染色体に組み込まれる可能性がある。グラム陰性細胞では、余分な膜が存在するため、DNA は外膜上のセクレチンによって形成されるチャネルを必要とする。ピリンはコンピテンスに必要かもしれないが、その役割は不明である。[ 22 ] DNA の取り込みは一般に配列特異的ではないが、一部の種では特異的な DNA 取り込み配列の存在が効率的な DNA 取り込みを促進する可能性がある。[ 23 ]

自然な変化

自然形質転換は、DNA移動のための細菌の適応であり、多数の細菌遺伝子の発現に依存しており、これらの遺伝子の産物がこの過程を担っていると考えられている。[ 20 ] [ 19 ]一般的に、形質転換は複雑でエネルギーを必要とする発生過程である。細菌が外来DNAを結合し、取り込み、染色体に組み込むためには、細菌はコンピテントになる、つまり特別な生理学的状態に入る必要がある。枯草菌におけるコンピテント状態の発達には約40個の遺伝子の発現が必要である。[ 24 ]宿主染色体に組み込まれるDNAは通常（まれな例外はあるが）、同種の別の細菌に由来し、したがって宿主の染色体と相同である。

B. subtilisでは、転移DNAの長さは1271 kb（100万塩基以上）以上である。[ 25 ]転移される長さは二本鎖DNAである可能性が高く、染色体総長4215 kbの3分の1以上になることが多い。[ 26 ]受容細胞の約7～9%が染色体全体を占めると思われる。[ 27 ]

自然形質転換の能力は多くの原核生物で見られるようで、これまでに67種の原核生物種（7つの異なる門）がこの過程を経ることが知られている。[ 19 ]

形質転換のコンピテンスは、通常、細菌の増殖の定常期に関連する条件である、高い細胞密度および/または栄養制限によって誘導されます。インフルエンザ菌における形質転換は、細菌の増殖が定常期に近づく指数関数的増殖の終わりに最も効率的に起こります。[ 28 ]ミュータンス菌（Streptococcus mutans）および他の多くの連鎖球菌における形質転換は、高い細胞密度で起こり、バイオフィルム形成と関連しています。[ 29 ]枯草菌におけるコンピテンスは、特にアミノ酸制限条件下で、対数増殖の終わりに向かって誘導されます。[ 30 ]同様に、あまり研究されていない放線菌門の代表であるMicrococcus luteusでは、コンピテンスは指数関数的増殖期の中期から後期に発達し、アミノ酸飢餓によって引き起こされます。[ 31 ] [ 32 ]

特定のバクテリオファージは、宿主とプラスミドDNAをそのまま放出することで形質転換に寄与すると考えられている。[ 33 ]

DNA修復への適応としての形質転換

コンピテンスはDNA損傷条件によって特異的に誘導される。例えば、肺炎球菌ではDNA損傷剤であるマイトマイシンC（DNA架橋剤）とフルオロキノロン（二本鎖切断を引き起こすトポイソメラーゼ阻害剤）によって形質転換が誘導される。[ 34 ] B. subtilis では、DNA損傷剤である紫外線によって形質転換が促進される。[ 35 ] Helicobacter pyloriでは、DNAジャイレースと相互作用して二本鎖切断を誘導するシプロフロキサシンがコンピテンス遺伝子の発現を誘導し、形質転換の頻度を高める。[ 36 ] Charpentierら[ 37 ]はLegionella pneumophilaを用いて64種類の毒性分子を試験し、どれがコンピテンスを誘導するかを調べた。これらのうち、DNA損傷剤である6種類だけが強い誘導を引き起こした。これらのDNA損傷剤は、マイトマイシンC（DNA鎖間架橋を引き起こす）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ナリジクス酸（DNAジャイレースの阻害剤で二本鎖切断を引き起こす[ 38 ]）、ビシクロマイシン（一本鎖および二本鎖切断を引き起こす[ 39 ]）、およびヒドロキシウレア（DNA塩基の酸化を誘導する[ 40 ]）であった。紫外線もL. pneumophilaで形質転換能を誘導した。Charpentierら[ 37 ]は、形質転換能はDNA損傷への応答として進化した可能性が高いと示唆した。極めて放射線耐性の高い細菌デイノコッカス・ラジオデュランスにおける自然形質転換は、ストレス条件下でのDNA損傷の修復と関連している[ 41 ] 。

対数増殖期の細菌は、細胞内に存在するゲノムコピー数に関して定常期の細菌とは異なり、これは重要なDNA修復プロセスを実行する能力に影響を与えます。対数増殖期には、細胞分裂と染色体複製が正確に一致しないため、細菌細胞内に染色体の特定領域が2つ以上存在することがあります。相同組換え修復（HRR）プロセスは、二本鎖切断などの二本鎖損傷の修復に特に効果的な重要なDNA修復プロセスです。このプロセスは、損傷した染色体に加えて、もう一方の相同染色体に依存します。対数増殖期には、一方の染色体のDNA損傷は、もう一方の相同染色体の配列情報を用いたHRRによって修復される可能性があります。しかし、細胞が定常期に近づくと、通常は染色体が1コピーだけになり、HRRは形質転換によって細胞外から相同鋳型を入力する必要があります。[ 42 ]

形質転換の適応機能が DNA 損傷の修復であるかどうかをテストするために、損傷因子として UV 光を照射したB. subtilisを使用した一連の実験が行われました (レビュー: Michod ら[ 43 ]および Bernstein ら[ 42 ] )。これらの実験の結果から、形質転換 DNA は、受容側 DNA に UV 光によって導入された潜在的に致命的な DNA 損傷を修復するように作用することが示されました。修復を担う特定のプロセスは HRR である可能性が高いです。細菌の形質転換は、2 つの個体からの相同 DNA が相互作用して組み換え DNA を形成し、それが次の世代に受け継がれるため、原始的な性的プロセスと見なすことができます。細菌の原核生物の形質転換は、真核生物の減数分裂による有性生殖をもたらした祖先のプロセスであった可能性があります ( 「有性生殖の進化」の「減数分裂」を参照)。

実験室での形質転換の方法とメカニズム

細菌の形質転換の概略図 – まず人工的なコンピテンスを誘導する必要がある

細菌性

人工的なコンピテンスは、自然界では通常発生しない条件に細胞をさらすことで、細胞を受動的にDNAを透過させる実験的手法によって誘導することができる。[ 44 ]典型的には、細胞は二価陽イオン（多くの場合、塩化カルシウム）を含む溶液中で低温条件下で培養され、その後、熱パルス（熱ショック）に曝露される。塩化カルシウムは細胞膜​​を部分的に破壊し、組換えDNAが宿主細胞内に侵入することを可能にする。DNAを取り込むことができる細胞はコンピテント細胞と呼ばれる。

20 mM Mg中でのグラム陰性細菌の増殖は、イオン結合と共有結合の比率を増加させることによってタンパク質とリポ多糖の結合の数を減らし、膜の流動性を高めて形質転換を促進することがわかっています。 [ 45 ]ここでのリポ多糖の役割は、おそらくDNAのアクセシビリティが向上したため、より短いO側鎖がより効果的に変換されるという観察から検証されています。

大腸菌などの細菌の表面は、細胞表面のリン脂質やリポ多糖類によって負に帯電しており、DNAも負に帯電しています。したがって、二価陽イオンの機能の一つは、リン酸基などの負電荷と配位結合することで電荷を遮蔽し、DNA分子が細胞表面に付着できるようにすることです。

大腸菌細胞へのDNAの進入は、接着帯またはバイエル結合と呼ばれるチャネルを介して行われ、典型的な細胞には最大400個の接着帯が存在する。これらのチャネルの役割は、コバラミン（これもこれらのチャネルを利用する）がDNAの取り込みを競合的に阻害することが発見されたことで確立された。DNA取り込みに関与すると考えられる別のチャネルは、ポリ(HB):ポリP:Caである。このチャネルでは、ポリ(HB)がDNA（それ自体がポリリン酸）を包み込み、Caイオンによって形成されるシールドに保持されると考えられている。[ 45 ]

低温条件下で細胞を二価陽イオンに曝露すると、細胞表面構造が変化または弱まり、DNAの透過性が高まる可能性も示唆されています。熱パルスは細胞膜全体に熱不均衡をもたらし、DNAが細胞孔または損傷した細胞壁から細胞内に侵入すると考えられています。

電気穿孔法は、コンピテンスを促進するもう一つの方法です。この方法では、細胞に10～20 kV /cmの電界を短時間印加します。これにより細胞膜に穴が開き、プラスミドDNAがそこから侵入できると考えられています。電気ショック後、穴は細胞膜修復機構によって急速に閉じられます。

酵母

サッカロミセス・セレビシエを含むほとんどの酵母種は、環境中の外来DNAによって形質転換される可能性があります。実験室でこの形質転換を高頻度に促進するためのいくつかの方法が開発されています。[ 46 ]

  • 酵母細胞は酵素処理によって細胞壁を分解し、スフェロプラストを形成する。この細胞は非常に脆いが、外来DNAを高率に取り込む。[ 47 ]
  • セシウムやリチウムなどのアルカリ陽イオンに無傷の酵母細胞をさらすと、細胞はプラスミドDNAを取り込むことができる。[ 48 ]その後のプロトコルでは、酢酸リチウム、ポリエチレングリコール、一本鎖DNAを使用してこの形質転換法が採用された。[ 49 ]これらのプロトコルでは、一本鎖DNAが酵母細胞壁に優先的に結合し、プラスミドDNAの結合を阻止して形質転換に利用できるようにしている。[ 50 ]
  • 電気穿孔法：電気ショックを用いて細胞膜に一時的な穴を開ける。これにより、細菌の場合と同様にDNAが侵入できるようになる。[ 51 ]
  • 酵素消化[ 52 ]またはガラスビーズによる撹拌[ 53 ]も酵母細胞の形質転換に使用することができる。

効率– 酵母の属や種によって、外来DNAの取り込み効率は異なります。[ 54 ]また、ほとんどの形質転換プロトコルはパン酵母であるS. cerevisiae用に開発されているため、他の種には最適ではない可能性があります。同じ種であっても、株によって形質転換効率が異なり、時には3桁も異なることがあります。例えば、S. cerevisiae株をプラスミドYEp13 10μgで形質転換した場合、DKD-5D-H株では550～3115個のコロニーが得られましたが、OS1株では5個未満のコロニーしか得られませんでした。[ 55 ]

植物

植物細胞にDNAを導入する方法は数多くあります。ベクターを介した方法としては、以下のようなものがあります。

  • アグロバクテリウムを介した形質転換は、最も簡単でシンプルな植物の形質転換です。植物組織（多くの場合、葉）を10×10mmなどの小片に切り、アグロバクテリウムを懸濁した液体に10分間浸します。細菌は、切り口で露出した多くの植物細胞に付着します。植物細胞は、傷に関連したフェノール化合物を分泌し、これが今度はアグロバクテリウムの毒性オペロンをアップレギュレーションする働きをします。毒性オペロンには、細菌タンパク質およびDNA（境界配列と呼ばれる特定の認識モチーフによって区切られ、毒性プラスミドから1本鎖として切り出されたもの）を線毛と呼ばれる構造を通して植物細胞に輸出するIV型分泌システムの一部であるタンパク質をコードする多くの遺伝子が含まれています。導入されたDNA（T-DNAと呼ばれる）は、アグロバクテリウムタンパク質VirD2に含まれる核局在シグナルによって植物細胞核へと誘導されます。VirD2は、T-DNAの右境界（RB）末端に共有結合しています。T-DNAが宿主植物のゲノムDNAにどのように組み込まれるかは、植物生物学研究の活発な分野です。T-DNAに選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子など）が含まれていると仮定すると、形質転換された植物組織を選択培地で培養してシュートを発生させることができます。その後、シュートは別の培地に移され、根の形成が促進されます。トランスジェニックシュートから根が成長し始めると、植物は土壌に移植され、通常のライフサイクル（種子の形成）を完了します。この最初の植物（T1、最初のトランスジェニック世代と呼ばれる）の種子は、選択培地（抗生物質を含む）に植えることができます。また、除草剤耐性遺伝子が使用されている場合は、土壌に植えて後日除草剤で処理し、野生型の分離株を死滅させることもできます。

シロイヌナズナなどの一部の植物種は、花または植物全体をアグロバクテリウム（典型的にはC58株）の懸濁液に浸すことで形質転換が可能です（C＝チェリー、58＝1958年、ニューヨーク州イサカのコーネル大学果樹園のチェリーの木からこの特定のA. tumefaciens [ a ]株が分離された年）。この方法による形質転換が困難な植物は依然として多くありますが、この方法で形質転換に成功した種のリストを増やす研究が継続されています。

  • ウイルスによる形質転換（形質導入）：目的の遺伝物質を適切な植物ウイルスに組み込み、この改変ウイルスを植物に感染させる。遺伝物質がDNAの場合、染色体と組み換えられ、形質転換細胞が生成される。しかし、ほとんどの植物ウイルスのゲノムは一本鎖RNAで構成されており、感染細胞の細胞質内で複製される。このようなゲノムの場合、挿入された遺伝子は細胞核に到達せず、宿主ゲノムに組み込まれないため、この方法はトランスフェクションの一種であり、真の形質転換ではない。感染した植物の子孫はウイルスフリーであり、挿入された遺伝子も存在しない。

ベクトルを使用しない方法には次のようなものがあります。

  • 遺伝子銃：粒子銃、マイクロプロジェクタイル銃、バイオリスティックスとも呼ばれます。金またはタングステンの粒子にDNAをコーティングし、若い植物細胞または植物胚に撃ち込みます。遺伝物質の一部は細胞内に留まり、細胞を形質転換します。この方法では植物のプラスチドの形質転換も可能です。形質転換効率はアグロバクテリウムを介した形質転換よりも低いですが、ほとんどの植物はこの方法で形質転換できます。
  • 電気穿孔法：高電場強度の電気パルスを用いて細胞膜に一時的な穴を開ける。これにより、細菌の場合と同様にDNAが細胞内に侵入することができる。[ 57 ]

菌類

遺伝子組み換え真菌を作製する方法はいくつかありますが、そのほとんどは植物に用いられる方法と類似しています。しかし、真菌は、その微細構造や生化学的特性により、異なる扱い方をする必要があります。

  • 大きな問題は、一部の菌類が二核細胞の状態にあることです。二核細胞は、それぞれの親菌類から1つずつ、2つの単倍体核を含んでいます。これらのうち1つだけが形質転換した場合（通常はそうなります）、形質転換した核の割合は胞子形成ごとに減少します。[ 58 ]
  • 真菌の細胞壁は非常に厚く、DNAの取り込みを阻害するため、（部分的な）除去が必要になることが多い。[ 59 ]場合によっては完全な分解が必要であり、[ 58 ]原形質体が得られる。
  • 菌糸体は糸状の菌糸から構成され、菌糸は内部の細胞壁によって隔てられていますが、細胞壁は栄養分や細胞小器官、時には核さえも通過できるほど大きな孔によって分断されています。そのため、個々の細胞は通常分離できません。これは、隣接する形質転換細胞が、抗生物質耐性のための栄養素やタンパク質を供給するなど、形質転換されていない細胞を選抜処理に対して耐性にしてしまう可能性があるため、問題となります。[ 58 ]
  • さらに、これらの菌類の成長（およびそれに伴う有糸分裂）は菌糸の先端でのみ起こるため、これも問題を引き起こす可能性がある。[ 58 ]

前述のように、植物の形質転換に使用されるさまざまな方法は、菌類でも機能します。

  • アグロバクテリウムは植物だけでなく真菌にも感染するが、植物とは異なり、真菌はアグロバクテリウムの発育に必要なフェノール化合物を分泌しないため、アセトシリンゴンなどの形で添加する必要がある。[ 58 ]
  • 真菌における小さなRNAの発現系の開発により、真菌細胞へのCRISPR/CAS9システムの導入が可能になった。[ 58 ] 2016年に米国農務省は、子実体の褐変を防ぐためにCRISPR/CAS9で編集された白ボタンマッシュルームの株を規制しないと発表し、CRISPR/CAS9で編集された作物を市場に出すことについて幅広い議論を引き起こした。[ 60 ]
  • 電気穿孔法、バイオリスティックス（遺伝子銃）、超音波によって生成された気泡のキャビ​​テーションを利用して細胞膜を貫通するソノポレーションなどの物理的方法も真菌に適用できます。 [ 61 ]

動物

動物細胞への DNA の導入は通常「トランスフェクション」と呼ばれ、対応する記事で説明されています。

分子生物学における形質転換の実践的側面

細菌において人工的に誘導されたコンピテンスの発見により、大腸菌などの細菌は、DNA操作やタンパク質発現のための便利な宿主として利用できるようになりました。大腸菌の形質転換には、通常、プラスミドが用いられます。プラスミドDNA分子が細胞内で安定的に維持されるためには、複製開始点（オリジン）を含んでいなければなりません。これにより、細胞自身の染色体の複製とは独立して、プラスミドDNAが細胞内で複製されます。

コンピテント培養物が外来DNAを取り込み、遺伝子を発現する効率は形質転換効率と呼ばれ、使用したDNA 1μgあたりのコロニー形成単位（cfu）で測定されます。pUC19のような小さなプラスミドの場合、形質転換効率が1×10 8 cfu/μgであれば、おおよそ2000分子のプラスミドのうち1分子が形質転換されたことになります。

塩化カルシウム変換では、細胞をCa存在下で冷却することによって細胞を調製する。2歳以上（CaCl中2化学的手法では、細胞がプラスミド DNAを透過できるようになります。細胞を氷上で DNA と共にインキュベートし、短時間ヒートショックを与えます ( たとえば、42 °C で 30～120 秒間 )。この方法は、環状プラスミド DNA に非常に有効です。市販されていない調製物では通常、プラスミド 1 マイクログラムあたり 10 6～ 10 7 個の形質転換体が得られます。粗悪な調製物では約 10 4 /μg 以下になりますが、良質のコンピテント細胞調製物ではプラスミド 1 マイクログラムあたり最大約 10 8個のコロニーが得られます。 [ 62 ]ただし、10 9を超える形質転換効率を生み出すスーパーコンピテント細胞を作成するためのプロトコルが存在します。[ 63 ]ただし、この化学的手法は、おそらく細胞本来のエキソヌクレアーゼ酵素が線状 DNA を急速に分解するため、染色体 DNA の断片などの線状 DNA にはうまく機能しません。対照的に、天然にコンピテントな細胞では、通常、プラスミド DNA よりも線状 DNA の方が効率的に形質転換されます。

CaClを用いた形質転換効率2この方法はプラスミドのサイズとともに減少するため、大きなプラスミドDNAの取り込みには電気穿孔法の方が効果的な方法である可能性がある。[ 64 ]電気穿孔法に使用する細胞は、電気穿孔法の過程で火花を発生させる可能性のある荷電粒子を除去するために、最初に冷たい再蒸留水で洗浄して準備する必要がある。

プラスミド形質転換における選択とスクリーニング

形質転換では通常、比較的少数の形質転換細胞と多数の非形質転換細胞の混合物が生成されるため、プラスミドを獲得した細胞を選択する方法が必要である。[ 65 ]そのため、プラスミドには、プラスミドを持たない細胞を死滅させるか、成長を停止させるための選択マーカーが必要である。抗生物質耐性は、原核生物で最も一般的に使用されるマーカーである。形質転換プラスミドには、細菌が通常は感受性である抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が含まれている。処理された細胞の混合物は、形質転換細胞のみが成長できるように、抗生物質を含む培地で培養される。別の選択方法は、特定のアミノ酸、ヌクレオチド、または糖の代謝能力の欠如を補うことができる特定の栄養要求性マーカーを使用するものである。この方法では、特定の生体分子の合成または有用性が欠損している適切に変異した株を使用する必要があり、形質転換細胞は、プラスミドを含む細胞のみが成長できる培地で培養される。

クローニング実験では、形質転換に使用するプラスミドに遺伝子が挿入される場合があります。しかし、このような実験では、すべてのプラスミドに正常に挿入された遺伝子が含まれているとは限りません。そのため、挿入されたプラスミドを含む形質転換細胞をスクリーニングするために、追加の技術が使用されることがあります。青白スクリーニングで使用されるβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子などのレポーター遺伝子をマーカーとして使用できます。このスクリーニング法は、プラスミド内のlacZ遺伝子のフラグメント( lacZα ) が細胞内の別の変異lacZ遺伝子 ( lacZΔM15 ) を補完できるという α補完の原理に基づいています。両方の遺伝子は単独では非機能性ペプチドを生成しますが、lacZ-αを含むプラスミドがlacZΔM15細胞に形質転換される場合のように、一緒に発現されると、機能的な β-ガラクトシダーゼを形成します。活性 β-ガラクトシダーゼの存在は、細胞がX-gal を含むプレートで増殖し、特徴的な青いコロニーを形成するときに検出できます。しかし、目的遺伝子をプラスミドベクターにライゲーションできるマルチクローニングサイトは、 lacZα遺伝子内に位置しています。そのため、ライゲーションが成功するとlacZα遺伝子が破壊され、機能的なβ-ガラクトシダーゼが形成できず、白いコロニーが形成されます。ライゲーションに成功したインサートを含む細胞は、白色を呈することで、ライゲーションに失敗した青いコロニーと容易に識別できます。

他によく用いられるレポーター遺伝子としては、青色光下で緑色に発光する細胞を生成する緑色蛍光タンパク質（GFP）や、ルシフェリンとの反応を触媒して発光する酵素ルシフェラーゼなどがあります。組換えDNAは、放射性RNAプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションなどの他の方法を用いて検出することもできます。また、プラスミドから目的のタンパク質を発現した細胞は、免疫学的手法を用いて検出することもできます。

参考文献

  1. ^ C58株のゲノム配列は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの基準株（旧B6株および新A1株）と十分に類似していないため、同一種とみなすことはできません。Lassalle et al. 2011は、この株を含む名称として「 Agrobacterium fabrum」を提案しましたが、その名称は検証されていません。 [ 56 ]
  1. ^ a b c d e f g h Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP (2014年3月). 「細菌による形質転換：分布、共通メカニズム、そして分岐制御」. Nature Reviews. Microbiology . 12 (3): 181–96 . doi : 10.1038/nrmicro3199 . PMID  24509783. S2CID  23559881 .
  2. ^ a b Alberts B , Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2002). Molecular Biology of the Cell . New York: Garland Science. p. G:35. ISBN 978-0-8153-4072-0。
  3. ^ Griffith F (1928). 「肺炎球菌の種類の重要性」 . The Journal of Hygiene . 27 (2): 113–59 . doi : 10.1017/s0022172400031879 . PMC 2167760. PMID 20474956 .  
  4. ^ケース、クリスティン; ファンケ、バーデル; トルトラ、ジェラード. 微生物学入門（第10版）
  5. ^ Lederberg, Joshua (1994). 「DNAによる遺伝学の変容：AVERY, MACLEOD, MCCARTY(1944)による遺伝学に関する逸話的、歴史的、批判的論評の記念すべき年」 . Genetics . 136 (2): 423–6 . doi : 10.1093/genetics/136.2.423 . PMC 1205797. PMID 8150273 .  
  6. ^ Mandel M, Higa A (1970年10月). 「カルシウム依存性バクテリオファージDNA感染」. Journal of Molecular Biology . 53 (1): 159– 62. doi : 10.1016/0022-2836(70)90051-3 . PMID 4922220 . 
  7. ^ Cohen SN , Chang AC, Hsu L (1972年8月). 「細菌における非染色体性抗生物質耐性：R因子DNAによる大腸菌の遺伝的形質転換」 .米国科学アカデミー紀要. 69 (8): 2110–4 . Bibcode : 1972PNAS...69.2110C . doi : 10.1073/pnas.69.8.2110 . PMC 426879. PMID 4559594 .  
  8. ^ Hanahan D (1983年6月). 「プラスミドを用いた大腸菌の形質転換に関する研究」. Journal of Molecular Biology . 166 (4): 557–80 . Bibcode : 1983JMBio.166..557H . CiteSeerX 10.1.1.460.2021 . doi : 10.1016/S0022-2836(83)80284-8 . PMID 6345791 .  
  9. ^ Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S (1989年3月). 「エレクトロポレーションによる11属に属するグラム陰性細菌の様々な種の形質転換」. Molecular & General Genetics . 216 (1): 175–7 . Bibcode : 1989MolGG.216..175W . doi : 10.1007/BF00332248 . PMID 2659971. S2CID 25214157 .  
  10. ^ Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG, Birnberg NC, Evans RM (1982年12月). 「メタロチオネイン-成長ホルモン融合遺伝子をマイクロインジェクションした卵子から発生したマウスの劇的な成長」 . Nature . 300 ( 5893): 611–5 . Bibcode : 1982Natur.300..611P . doi : 10.1038/300611a0 . PMC 4881848. PMID 6958982 .  
  11. ^ネスター、ユージン. 「アグロバクテリウム：天然の遺伝子工学者（100年後）」 . APS . アメリカ植物病理学会. 2011年1月14日閲覧。
  12. ^ Zambryski P, Joos H, Genetello C, Leemans J, Montagu MV, Schell J (1983). 「植物細胞へのDNA導入における、通常の再生能力を損なうことのないTiプラスミドベクター」 . The EMBO Journal . 2 (12): 2143–50 . Bibcode : 1983EMBO....2.2143Z . doi : 10.1002 / j.1460-2075.1983.tb01715.x . PMC 555426. PMID 16453482 .  
  13. ^ピーターズ、パメラ. 「植物の形質転換 - 基本的な遺伝子工学技術」 .アクセス・エクセレンス. 2010年1月28日閲覧。
  14. ^ 「生物学者、DNAを含んだ細胞を撃つ銃を発明」(PDF)コーネル・クロニクル1987年5月14日 p.3.
  15. ^ Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987). 「粒子衝撃法を用いた細胞および組織への物質の送達」. Journal of Particulate Science and Technology . 5 : 27–37 . doi : 10.1080/02726358708904533 .
  16. ^ Klein RM, Wolf ED, Wu R, Sanford JC (1992). 「生細胞への核酸送達のための高速マイクロプロジェクタイル. 1987」. Biotechnology (Reading, Mass.) . 24 : 384–6 . PMID 1422046 . 
  17. ^ a b c Michod RE, Bernstein H, Nedelcu AM (2008年5月). 「微生物病原体における性別の適応価値」.感染・遺伝学・進化. 8 (3): 267–85 . Bibcode : 2008InfGE...8..267M . doi : 10.1016/j.meegid.2008.01.002 . PMID 18295550 . 
  18. ^ a b Seitz P, Blokesch M (2013年5月). 「病原性および環境性グラム陰性細菌の自然なコンピテンスと形質転換に関与する手がかりと制御経路」(PDF) . FEMS Microbiology Reviews . 37 (3): 336– 63. Bibcode : 2013FEMMR..37..336S . doi : 10.1111/j.1574-6976.2012.00353.x . PMID 22928673 . 
  19. ^ a b c Johnsborg O, Eldholm V, Håvarstein LS (2007年12月). 「自然な遺伝子形質転換：その発生率、メカニズム、そして機能」 . Research in Microbiology . 158 (10): 767–78 . doi : 10.1016/j.resmic.2007.09.004 . PMID 17997281 . 
  20. ^ a b Chen I, Dubnau D (2004年3月). 「細菌形質転換中のDNA取り込み」. Nature Reviews. Microbiology . 2 (3): 241–9 . doi : 10.1038/nrmicro844 . PMID 15083159. S2CID 205499369 .  
  21. ^ Lacks S, Greenberg B, Neuberger M (1974年6月). 「肺炎球菌の遺伝的形質転換におけるデオキシリボヌクレアーゼの役割」 .米国科学アカデミー紀要. 71 (6): 2305–9 . Bibcode : 1974PNAS...71.2305L . doi : 10.1073/pnas.71.6.2305 . PMC 388441. PMID 4152205 .  
  22. ^ Long CD, Tobiason DM, Lazio MP, Kline KA, Seifert HS (2003年11月). 「低レベルのピリン発現は淋菌におけるDNA形質転換能を高める」 .感染と免疫. 71 (11): 6279–91 . doi : 10.1128 / iai.71.11.6279-6291.2003 . PMC 219589. PMID 14573647 .  
  23. ^ Sisco KL, Smith HO (1979年2月). 「ヘモフィルス菌形質転換における配列特異的DNA取り込み」 .米国科学アカデミー紀要. 76 (2): 972–6 . Bibcode : 1979PNAS...76..972S . doi : 10.1073/pnas.76.2.972 . PMC 383110. PMID 311478 .  
  24. ^ Solomon JM, Grossman AD (1996年4月). 「誰がいつコンピテンスを持つのか：細菌における自然遺伝的コンピテンスの調節」Trends in Genetics . 12 (4): 150–5 . doi : 10.1016/0168-9525(96)10014-7 . PMID 8901420 . 
  25. ^斉藤雄一、田口英之、赤松毅（2006年3月）「枯草菌のコンピテントセルへの取り込み後の細菌ゲノムの運命：取り込まれたDNAの連続長」Journal of Bioscience and Bioengineering . 101 (3): 257–62 . doi : 10.1263/jbb.101.257 . PMID 16716928 . 
  26. ^斉藤 雄一、田口 英之、赤松 毅 (2006年4月). 「Bacillus subtilis のコンピテントセルに溶解プロトプラスト形質転換により取り込まれるDNAはssDNAではなくdsDNAである」. Journal of Bioscience and Bioengineering . 101 (4): 334–9 . doi : 10.1263/jbb.101.334 . PMID 16716942 . 
  27. ^ Akamatsu T, Taguchi H (2001年4月). 「プロトプラストライセート中の全染色体DNAの枯草菌コンピテント細胞への組み込み」 .バイオサイエンス、バイオテクノロジー、生化学. 65 (4): 823–9 . doi : 10.1271/bbb.65.823 . PMID 11388459. S2CID 30118947 .  
  28. ^ Goodgal SH, Herriott RM (1961年7月). 「ヘモフィルス・インフルエンザ菌の形質転換に関する研究. I. コンピテンス」 . The Journal of General Physiology . 44 (6): 1201–27 . doi : 10.1085/jgp.44.6.1201 . PMC 2195138. PMID 13707010 .  
  29. ^ Aspiras MB, Ellen RP, Cvitkovitch DG (2004年9月). 「バイオフィルム内で増殖するStreptococcus mutansのComX活性」. FEMS Microbiology Letters . 238 (1): 167– 74. doi : 10.1016/j.femsle.2004.07.032 (2025年7月22日非アクティブ). PMID 15336418 . {{cite journal}}: CS1 maint: DOIは2025年7月時点で非アクティブです（リンク）
  30. ^ Anagnostopoulos C, Spizizen J (1961年5月). 「枯草菌における形質転換の要件」 . Journal of Bacteriology . 81 (5): 741–6 . Bibcode : 1961JBact..81..741A . doi : 10.1128/JB.81.5.741-746.1961 . PMC 279084. PMID 16561900 .  
  31. ^アンジェロフ、天使;バーゲン、ポール。フロリアン・ナドラー。ホルンブルク、フィリップ。リチェフ、アントニ。 「ベラッカー、マリア」パクル、フィオナ。クスター、ベルンハルト。ヴォルフガング・リーブル（2015年2月10日）。「新規のFlp線毛生合成依存性の自然形質転換」。微生物学のフロンティア。6 : 84.土井: 10.3389/fmicb.2015.00084。PMC 4322843。PMID 25713572。  
  32. ^ Lichev, Antoni; Angelov, Angel; Cucurull, Inigo; Liebl, Wolfgang (2019年7月30日). 「栄養因子としてのアミノ酸と、厳密な応答の警報因子としての(p)ppGppがMicrococcus luteusの自然形質転換を制御する」 . Scientific Reports . 9 (1): 11030. Bibcode : 2019NatSR...911030L . doi : 10.1038/s41598-019-47423- x . PMC 6667448. PMID 31363120 .  
  33. ^ Keen EC, Bliskovsky VV, Malagon F, Baker JD, Prince JS, Klaus JS, Adhya SL (2017年1月). 「新規「スーパースプレッダー」バクテリオファージは形質転換によって水平遺伝子伝播を促進する」 . mBio . 8 ( 1) e02115-16: e02115–16. Bibcode : 2017mBio....815.16K . doi : 10.1128/mBio.02115-16 . PMC 5241400. PMID 28096488 .  
  34. ^ Claverys JP, Prudhomme M, Martin B ( 2006). 「グラム陽性細菌におけるストレスに対する一般的な応答としてのコンピテンスレギュロンの誘導」Annual Review of Microbiology 60 : 451–75 . doi : 10.1146/annurev.micro.60.080805.142139 . PMID 16771651 . 
  35. ^ミホド RE、ヴォイチェホフスキ MF、ヘルツァー MA (1988 年 1 月)。「細菌Bacillus subtilisにおけるDNA修復と形質転換の進化」。遺伝学。118 (1): 31–9 .土井: 10.1093/genetics/118.1.31。PMC 1203263。PMID 8608929。  
  36. ^ Dorer MS, Fero J, Salama NR (2010年7月). Blanke SR (編). 「DNA損傷はヘリコバクター・ピロリにおける遺伝子交換を引き起こす」 . PLOS Pathogens . 6 (7) e1001026. doi : 10.1371/journal.ppat.1001026 . PMC 2912397. PMID 20686662 .  
  37. ^ a b Charpentier X, Kay E, Schneider D, Shuman HA (2011年3月). 「抗生物質と紫外線照射はレジオネラ・ニューモフィラの自然形質転換能を誘導する」 . Journal of Bacteriology . 193 (5): 1114–21 . doi : 10.1128/JB.01146-10 . PMC 3067580. PMID 21169481 .  
  38. ^ Albertini S, Chételat AA, Miller B, Muster W, Pujadas E, Strobel R, Gocke E (1995年7月). 「原核生物および真核生物試験系における17種のジャイレース毒および4種の哺乳類トポイソメラーゼII毒の遺伝毒性」. Mutagenesis . 10 (4): 343–51 . doi : 10.1093/mutage/10.4.343 . PMID 7476271 . 
  39. ^ Washburn RS, Gottesman ME (2011年1月). 「転写終結は染色体の完全性を維持する」 . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 108 (2): 792–7 . Bibcode : 2011PNAS..108..792W . doi : 10.1073 / pnas.1009564108 . PMC 3021005. PMID 21183718 .  
  40. ^坂野 健、及川 聡、長谷川 健、川西 誠 (2001年11月). 「ヒドロキシウレアは過酸化水素と一酸化窒素の形成を介して部位特異的なDNA損傷を誘導する」 .日本癌学会誌. 92 (11): 1166–74 . doi : 10.1111/j.1349-7006.2001.tb02136.x . PMC 5926660. PMID 11714440 .  
  41. ^ Sharma DK, Soni I, Rajpurohit YS (2025年1月). 「嵐を生き抜く：ストレスを受けたデイノコッカス・ラジオデュランスの栄養とDNA修復における自然形質転換の役割を探る」 . Appl Environ Microbiol . 91 (1) e01371-24: e0137124. Bibcode : 2025ApEnM..91E1371S . doi : 10.1128/aem.01371-24 . PMC 11784314. PMID 39651863 .  
  42. ^ a b Bernstein H, Bernstein C, Michod RE (2012). 「第1章 細菌および真核生物における性行動の主要な適応機能としてのDNA修復」木村 誠・清水 誠（編）『DNA修復：新たな研究』Nova Sci. Publ., Hauppauge, NY pp.  1– 49. ISBN 978-1-62100-808-8。
  43. ^ Michod RE, Bernstein H, Nedelcu AM (2008年5月). 「微生物病原体における性別の適応価値」(PDF) .感染・遺伝学・進化. 8 (3): 267– 85. Bibcode : 2008InfGE...8..267M . doi : 10.1016/j.meegid.2008.01.002 . PMID 18295550.オリジナル(PDF)から2020年5月11日にアーカイブ. 2013年4月22日閲覧。 
  44. ^ Donahue RA, Bloom FR (1998年7月). 「高スループット効率の化学的コンピテント細胞による大規模形質転換」(PDF) . Focus . 第20巻第2号. pp.  54– 56. OCLC 12352630. 2013年3月6日時点のオリジナル(PDF)からアーカイブ– Invitrogenより。 
  45. ^ a b Srivastava S (2013).細菌の遺伝学(PDF) . インド: Springer-Verlag . doi : 10.1007/978-81-322-1090-0 . ISBN 978-81-322-1089-4. S2CID  35917467 .
  46. ^河合 誠、橋本 渉、村田 健（2010年11月1日）. 「サッカロミセス・セレビシエおよびその他の真菌の形質転換：方法と可能性のあるメカニズム」 .バイオエンジニアリングバグ. 1 (6): 395– 403. doi : 10.4161/bbug.1.6.13257 . PMC 3056089. PMID 21468206 .  
  47. ^ Hinnen A, Hicks JB, Fink GR (1978年4月). 「酵母の形質転換」 .米国科学アカデミー紀要. 75 (4 ) : 1929–33 . Bibcode : 1978PNAS...75.1929H . doi : 10.1073/pnas.75.4.1929 . PMC 392455. PMID 347451 .  
  48. ^伊藤 浩、福田 雄三、村田 憲、木村 章（1983年1月）. 「アルカリカチオン処理による無傷酵母細胞の形質転換」 . Journal of Bacteriology . 153 (1): 163–8 . Bibcode : 1983JBact.153..163I . doi : 10.1128 /JB.153.1.163-168.1983 . PMC 217353. PMID 6336730 .  
  49. ^ Gietz RD, Woods RA (2002). 「酢酸リチウム/一本鎖キャリアDNA/ポリエチレングリコール法による酵母の形質転換」酵母遺伝学および分子細胞生物学ガイド - パートB. Methods in Enzymology. 第350巻. pp.  87– 96. doi : 10.1016/S0076-6879(02)50957-5 . ISBN 978-0-12-182253-8. PMID  12073338 .
  50. ^ Gietz RD, Schiestl RH, Willems AR, Woods RA (1995年4月). 「LiAc/SS-DNA/PEG法による無傷酵母細胞の形質転換に関する研究」. Yeast . 11 ( 4): 355–60 . doi : 10.1002/yea.320110408 . PMID 7785336. S2CID 22611810 .  
  51. ^ Schiestl, Robert H.; Manivasakam, P.; Woods, Robin A.; Gietzt, R.Daniel (1993年8月1日). 「形質転換による酵母へのDNA導入」. Methods . 5 (2): 79– 85. doi : 10.1006/meth.1993.1011 .
  52. ^ Spencer, F.; Ketner, G.; Connelly, C.; Hieter, P. (1993年8月1日). 「酵母における標的組換えに基づく大きなDNAセグメントのクローニングと操作」. Methods . 5 (2): 161– 175. doi : 10.1006/meth.1993.1021 .
  53. ^ Costanzo MC, Fox TD (1988年11月). 「ガラスビーズを用いた撹拌による酵母の形質転換」 . Genetics . 120 ( 3): 667–70 . doi : 10.1093/genetics/120.3.667 . PMC 1203545. PMID 3066683 .  
  54. ^ Dohmen RJ, Strasser AW, Höner CB, Hollenberg CP (1991年10月). 「様々な酵母属のコンピテント細胞の長期保存を可能にする効率的な形質転換手順」. Yeast . 7 ( 7): 691–2 . doi : 10.1002/yea.320070704 . PMID 1776359. S2CID 7108750 .  
  55. ^葉山雄三、福田雄三、河合誠、橋本渉、村田健 (2002). 「グルタチオンと対数増殖初期細胞を用いた酵母サッカロミセス・セレビシエの極めて簡便、迅速、かつ高効率な形質転換法」. Journal of Bioscience and Bioengineering . 94 (2): 166– 71. doi : 10.1016/s1389-1723(02)80138-4 . PMID 16233287 . 
  56. ^ "種: アグロバクテリウム ファブラム" . lpsn.dsmz.de。
  57. ^ V.SinghとDKJain (2014). 「組換えDNAの応用」. ISC BIOLOGY . Nageen Prakashan. p. 840.
  58. ^ a b c d e fポイェディノク、ニュージャージー州;ブルーム、そうだね。 B. (2018 年 3 月)。 「菌類の遺伝子形質転換の進歩、問題点、そして展望」。細胞学と遺伝学。52 (2): 139–154。土井: 10.3103/S009545271802007X。ISSN 0095-4527。S2CID 4561837。  
  59. ^彼、リヤ。フォン、ジャオ。ルー、シャ。陳志文。チェン・チュンメイ。彼、やあ。イー、シウウェン。シー、リヤン（2017）。「菌類の遺伝子形質転換」。発生生物学の国際ジャーナル。61 ( 6–7 ): 375–381 .土井: 10.1387/ijdb.160026lh。ISSN 0214-6282。PMID 27528043。  
  60. ^ Waltz, Emily (2016年4月). 「遺伝子編集CRISPRマッシュルーム、米国の規制を回避」 . Nature . 532 (7599): 293. Bibcode : 2016Natur.532..293W . doi : 10.1038/nature.2016.19754 . ISSN 0028-0836 . PMID 27111611 .  
  61. ^リベラ、アナ・レオノール;マガニャ・オルティス、デニス。ゴメス・リム、ミゲル。フェルナンデス、フランシスコ。ロスケ、アヒム M. (2014 年 6 月)。 「真菌および酵母の遺伝子形質転換のための物理的方法」。生命の物理学のレビュー。11 (2): 184–203。ビブコード: 2014PhLRv..11..184R。土井：10.1016/j.plrev.2014.01.007。PMID 24507729。 
  62. ^細菌の形質転換 2010年6月10日アーカイブ- Wayback Machine
  63. ^井上 浩、野島 秀、岡山 秀（1990年11月）. 「プラスミドを用いた大腸菌の高効率形質転換」.遺伝子. 96 (1): 23–8 . doi : 10.1016/0378-1119(90)90336-P . PMID 2265755 . 
  64. ^ Donahue RA, Bloom FR (1998年9月). 「大きなプラスミドDNAを電気穿孔した大腸菌の形質転換効率」 (PDF) . Focus . 20 (3): 77–78 . 2011年9月3日時点のオリジナルよりアーカイブ。
  65. ^ Birnboim HC, Doly J (1979年11月). 「組換えプラスミドDNAのスクリーニングのための迅速アルカリ抽出法」 . Nucleic Acids Research . 7 (6): 1513–23 . doi : 10.1093/nar/7.6.1513 . PMC 342324. PMID 388356 .  
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