DNA複製
Biological process
DNA複製：二重らせん構造は「解かれ」、ほどかれ、分離されたそれぞれの鎖（青緑色）は、新しいパートナー鎖（緑色）を複製するための鋳型として機能します。ヌクレオチド（塩基）が一致することで、新しいパートナー鎖が2つの新しい二重らせん構造に合成されます。

DNA複製は、細胞が自身のDNAの正確​​なコピーを作成するプロセスです。[1] [2] [3] [4]このプロセスはすべての生物で起こり、生物学的遺伝、細胞分裂、損傷した組織の修復に不可欠です。DNA複製により、新たに分裂した娘細胞はそれぞれ、各DNA分子のコピーを受け取ることが保証されます。[5]

DNAは最も一般的には二本鎖の形で存在し、2本の相補的な 鎖が、それぞれの鎖を構成するヌクレオチドの塩基対合によって結合している。二本鎖DNA分子の2本の線状鎖は、通常、二重らせん状にねじれている。[6]複製の際には、2本の鎖が分離され、元のDNA分子の各鎖が相補的な鎖を生成するための鋳型として機能し、このプロセスは半保存的複製と呼ばれる。その結果、複製された各DNA分子は、元のDNA鎖1本と新たに合成されたDNA鎖1本で構成される。[7]細胞の校正およびエラーチェック機構により、DNA複製はほぼ完璧な忠実度で行われる。 [8] [9]

DNA複製は通常、ゲノム全体に散在する複製起点[10]と呼ばれる特定の場所から始まります。[11]複製起点でのDNAの巻き戻しは、ヘリカーゼと呼ばれる酵素によって行われ、複製起点から双方向に複製フォークが成長します。多数のタンパク質が複製フォークと関連しており、 DNA合成の開始と継続を助けます。最も顕著なのは、DNAポリメラーゼが鋳型鎖のヌクレオチドを補完するヌクレオチドを取り込むことで新しい鎖を合成することです。DNA複製は間期のS期（合成期）に起こります。[12]

DNA複製は試験管内（細胞外、人工的）にも行うことができます。 [13]細胞から単離したDNAポリメラーゼと人工DNAプライマーは、鋳型DNA分子内の既知の配列でDNA合成を開始するために使用できます。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写介在増幅（TMA）はすべて、この技術の一般的な例です。2021年3月、研究者らは、翻訳（遺伝暗号に従った新しいタンパク質の生物学的合成）に必要な要素である転移RNAの予備的な形態が、原始生命の初期の無生物起源​​において、それ自体が複製分子であった可能性があることを示唆する証拠を報告しました。[14] [15]

DNA構造

DNA二重らせん（B型DNA）の構造。構造内の原子は元素ごとに色分けされており、2つの塩基対の詳細な構造は右下に示されています

DNAは二重鎖構造で、両方の鎖が一緒に巻かれて特徴的な二重らせんを形成しています。DNAの各一本鎖は4種類のヌクレオチドの鎖です。DNA中のヌクレオチドはデオキシリボース糖、リン酸、核酸塩基を含みます。4種類のヌクレオチドは4つの核酸塩基に対応しており、アデニン、シトシン、グアニン、チミンで、一般的にそれぞれA、C、G、Tと略されます。アデニンとグアニンはプリン[16]核酸塩基であり、シトシンとチミンはピリミジンです。これらのヌクレオチドはリン酸ジエステル結合を形成し、核酸塩基が内側（つまり反対側の鎖）を向いたDNA二重らせんのリン酸-デオキシリボース骨格を形成します。相補的な核酸塩基は、水素結合を介して鎖間で一致し、塩基対を形成します。アデニンはチミンと対になり（2つの水素結合）、グアニンはシトシンと対になります（3つの水素結合）。[17]

DNA鎖には方向性があり、一本鎖の異なる末端は「3'（スリープライム）末端」と「5'（ファイブプライム）末端」と呼ばれます。慣例的に、一本鎖DNAの塩基配列が与えられた場合、配列の左端は5'末端、右端は3'末端です。二重らせん構造の鎖は逆平行で、一方が5'末端から3'末端、もう一方が3'末端から5'末端となります。これらの用語は、デオキシリボース分子を構成する炭素原子に番号を付ける化学的慣習を指し、鎖内の次のリン酸が結合する特定の炭素原子を示します。方向性はDNA合成に影響を与えます。なぜなら、DNAポリメラーゼはDNA鎖の3'末端にヌクレオチドを付加することによって、一方向にのみDNAを合成できるからです。[18]

DNA中の相補的な塩基の対合（水素結合による）は、各鎖に含まれる情報が冗長であることを意味します。ホスホジエステル結合（鎖内）は、水素結合（鎖間）よりも強力です。ホスホジエステル結合の実際の役割は、1つのヌクレオチドの5'炭素原子を別のヌクレオチドの3'炭素原子に結合させることであり、一方、水素結合はDNA二重らせんをらせん軸方向に安定化させますが、長軸方向には安定化させません。[19]これにより、鎖を互いに分離することが可能になります。したがって、1本の鎖上のヌクレオチドは、新たに合成されたパートナー鎖上のヌクレオチドを再構築するために使用できます。[20]

DNAポリメラーゼ

DNAポリメラーゼは、DNA鎖の3'末端にヌクレオチドを付加します。[21]ミスマッチが誤って組み込まれた場合、ポリメラーゼはそれ以上の伸長を阻害されます。校正によってミスマッチしたヌクレオチドが除去され、伸長が継続されます。

DNAポリメラーゼは、あらゆる形態のDNA複製を実行する酵素ファミリーです。 [22] DNAポリメラーゼは一般に、新しい鎖の合成を開始することはできませんが、鋳型鎖と対になった既存のDNAまたはRNA鎖を伸長することしかできません。合成を開始するには、プライマーと呼ばれる短いRNA断片を作成し、鋳型DNA鎖と対にする必要があります。

DNAポリメラーゼは、既存のヌクレオチド鎖の3'末端を伸長させることで新しいDNA鎖を付加し、ホスホジエステル結合の形成を介して、鋳型鎖に一致する新しいヌクレオチドを1つずつ追加しますDNA 重合のこの過程に必要なエネルギーは、組み込まれていない各塩基に結合した 3 つのリン酸間の高エネルギーリン酸(リン酸無水物) 結合の加水分解から得られる。糖分子 (DNA の場合はデオキシリボース) が結合した遊離塩基はヌクレオシドと呼ばれ、1 つ以上のリン酸基が結合したヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。特に、3 つのリン酸基が結合したヌクレオシドはヌクレオシド三リン酸と呼ばれる。遊離ヌクレオチドが成長中の DNA 鎖に加えられると、成長中の鎖内の遊離ヌクレオチドの近位リン酸と別のヌクレオチドのデオキシリボースとの間のリン酸ジエステル結合の形成と同時に、高エネルギーリン酸結合の加水分解が起こり、遊離ヌクレオチドの 2 つの遠位リン酸基がピロリン酸として遊離する。得られたピロリン酸を酵素的に分解して無機リン酸に変換すると、2つ目の高エネルギーリン酸結合が消費され、反応は事実上不可逆的になります。[注 1]

一般的に、DNAポリメラーゼは非常に正確で、固有のエラー率は10の7乗ヌクレオチド追加ごとに1つ未満のミスです。[23]一部のDNAポリメラーゼは、ミスマッチ塩基を修正するために、形成中の鎖の末端からヌクレオチドを削除することもできます。これは校正として知られています。最後に、複製後のミスマッチ修復機構はDNAのエラーを監視し、新しく合成されたDNA鎖のミスマッチを元の鎖配列と区別することができます。これら3つの識別ステップを組み合わせることで、10の9乗ヌクレオチド追加ごとに1つ未満のミスという複製の忠実度が可能になります。[23]

生細胞におけるDNA複製速度は、ファージに感染した大腸菌におけるT4ファージのDNA伸長速度として初めて測定されました。[24] 37℃での指数関数的なDNA増加期間中、速度は1秒あたり749ヌクレオチドでした。T4ファージによるDNA合成中の複製あたりの塩基対あたりの変異率は、10億個あたり1.7個です。 [ 25]

複製プロセス

DNA複製のステップの概要
DNA合成のステップ

DNA複製は、すべての生物学的重合プロセスと同様に、酵素触媒によって協調的に進行する3つの段階、すなわち開始、伸長、終結によって進行します。

開始

DNA複製開始におけるイニシエーターの役割
複製前複合体の形成

細胞が分裂するには、まずDNAを複製する必要があります。[26] DNA複製は全か無かのプロセスです。複製が始まると、完了まで進行します。複製が完了すると、同じ細胞周期で再び複製は発生しません。これは、複製前複合体の分裂または開始によって可能になります。[要出典]

複製前複合体

有糸分裂後期からG1期初期にかけて、DNAの特定の位置（「起点」と呼ばれる）で、イニシエータータンパク質の大きな複合体が複製前複合体に組み立てられる。[11] [10]大腸菌では主要なイニシエータータンパク質はDNA Aであり、酵母ではこれは起点認識複合体である。[27] イニシエータータンパク質が使用する配列は「ATリッチ」（アデニン塩基とチミン塩基に富む）になる傾向がある。これは、AT塩基対が（CG塩基対で形成される3つの水素結合ではなく）2つの水素結合を持ち、したがって鎖分離しやすいためである。[28] 真核生物では、起点認識複合体（ORC）がイニシエータータンパク質の複製前複合体への組み立てを触媒する。さらに、最近の報告では、出芽酵母ORCが細胞周期依存的に二量体化してライセンシングを制御することが示唆されている。[29] [30] [明確化が必要]次に、ORC の二量体化のプロセスは、生体内での細胞周期依存性の Noc3p 二量体化サイクルによって媒介され、この Noc3p の役割は、リボソーム生合成における役割とは分離可能である。必須の Noc3p 二量体化サイクルは、複製ライセンスにおける ORC ダブルヘキサマー形成を媒介し、Noc3p は細胞周期を通してクロマチンに継続的に結合している。[31]次に、 Cdc6とCdt1 は、複製起点で結合した複製起点認識複合体と会合して、 Mcm 複合体をDNA にロードするために必要な、より大きな複合体を形成する。真核生物では、Mcm 複合体は、複製フォークと複製起点で DNA ヘリックスを分割するヘリカーゼである。Mcm 複合体は G1 期後期にリクルートされ、ATP 依存性タンパク質リモデリングを介して ORC-Cdc6-Cdt1 複合体によって DNA にロードされる。 MCM複合体が起点DNAにロードされると、複製前複合体の形成が完了したことを示す。[32]

G1期後期に環境条件が適切であれば、G1およびG1/Sサイクリン-Cdk複合体が活性化され、DNA合成機構の構成要素をコードする遺伝子の発現が刺激されます。G1/S-Cdk活性化はS-Cdk複合体の発現と活性化も促進し、種や細胞の種類によっては複製起点の活性化に役割を果たす可能性があります。これらのCdkの制御は細胞の種類や発生段階によって異なります。この制御は出芽酵母で最もよく理解されており、SサイクリンClb5とClb6が主にDNA複製を担っています。[33] Clb5,6-Cdk1複合体は複製起点の活性化を直接引き起こすため、S期を通して各起点を直接活性化するために必要です。[32]

同様に、Cdc7はS期を通して複製起点を活性化するためにも必要です。Cdc7は細胞周期を通して活性であるわけではなく、DNA複製の早期開始を避けるために、その活性化は厳密にタイミングが調整されています。G1後期には、Cdc7の活性は、Cdc7に直接結合してタンパク質キナーゼ活性を促進する調節サブユニットDBF4との結合の結果として急激に上昇します。Cdc7は、複製起点活性の律速調節因子であることがわかっています。G1/S-Cdkおよび／またはS-CdkとCdc7は協力して複製起点を直接活性化し、DNA合成の開始につながります。[32]

開始前複合体

S期初期には、S-CdkとCdc7の活性化により、複製開始前複合体（複製起点に形成される巨大なタンパク質複合体）の組み立てが行われます。複製開始前複合体の形成により、複製起点の複製複合体からCdc6とCdt1が排除され、複製前複合体は不活性化され、分解されます。複製開始前複合体が複製起点にロードされると、Mcmヘリカーゼが活性化され、DNAヘリックスの巻き戻しが引き起こされます。また、複製開始前複合体は、α-プライマーゼやその他のDNAポリメラーゼもDNAにロードします。[32]

α-プライマーゼが最初のプライマーを合成した後、プライマー-テンプレート接合部はクランプローダーと相互作用し、クランプローダーはスライディングクランプをDNAにロードしてDNA合成を開始します。複製開始前複合体の構成要素は、複製起点から移動する際に複製フォークと会合したままになります。[32]

伸長

DNAポリメラーゼは5'-3'活性を持っています。既知のDNA複製システムはすべて、合成を開始する前に遊離の3'ヒドロキシル基を必要とします（注：DNAテンプレートは3'から5'方向に読み取られますが、新しい鎖は5'から3'方向に合成されます。これはしばしば混同されます）。DNA合成には4つの異なるメカニズムが認識されています。[要出典]

  1. すべての細胞生物と多くのDNAウイルス、ファージ、プラスミドは、プライマーゼを使用して遊離の3'OH基を持つ短いRNAプライマーを合成し、その後DNAポリメラーゼによって伸長されます。
  2. レトロエレメント（レトロウイルスを含む）は、逆転写酵素による伸長に使用される遊離の3'OH基を提供することでDNA複製をプライミングする転移RNAを使用します
  3. アデノウイルスとバクテリオファージのφ29ファミリーでは、3'OH基はゲノムに付着したタンパク質（末端タンパク質）のアミノ酸の側鎖によって提供され、DNAポリメラーゼによってヌクレオチドが付加されて新しい鎖が形成されます。
  4. サーコウイルス、ジェミニウイルス、パルボウイルスなどを含む一本鎖DNAウイルス、そしてローリングサークル複製（RCR）機構を用いる多くのファージやプラスミドでは、RCRエンドヌクレアーゼがゲノム鎖（一本鎖ウイルス）またはDNA鎖（プラスミド）の1つに切れ目を入れます。切れ目が入った鎖の5'末端はヌクレアーゼ上のチロシン残基に転移され、遊離した3'OH基はDNAポリメラーゼによって新しい鎖を合成するために使用されます

細胞生物はこれらの経路のうち最初のものを使用しており、これが最もよく知られています。このメカニズムでは、2本の鎖が分離されると、プライマーゼが鋳型鎖にRNAプライマーを追加します。リーディング鎖は1本のRNAプライマーを受け取り、ラギング鎖は複数のRNAプライマーを受け取ります。リーディング鎖は、高い処理能力を持つDNAポリメラーゼによってプライマーから連続的に伸長しますが、ラギング鎖は各プライマーから不連続に伸長し、岡崎断片を形成します。RNaseはプライマーRNA断片を除去し、複製ポリメラーゼとは異なる低い処理能力を持つDNAポリメラーゼがギャップを埋めるために介入します。これが完了すると、リーディング鎖に1つのニック、ラギング鎖に複数のニックが見られます。リガーゼはこれらのニックを埋めるように働き、新しく複製されたDNA分子を完成させます。[要出典]

このプロセスで使用されるプライマーゼは、細菌と古細菌／真核生物で大きく異なります。細菌は、TOPRIMフォールド型の触媒ドメインを含むDnaGタンパク質スーパーファミリーに属するプライマーゼを使用します。 [34] TOPRIMフォールドは、ロスマン型トポロジーを持つ4つの保存された鎖を持つα/βコアを含みます。この構造は、トポイソメラーゼIa、トポイソメラーゼII、OLDファミリーヌクレアーゼ、そしてRecRタンパク質に関連するDNA修復タンパク質の触媒ドメインにも見られます。[要出典]

対照的に、古細菌と真核生物が使用するプライマーゼは、RNA認識モチーフ（RRM）の高度に派生したバージョンを含んでいます。このプライマーゼは、DNA複製と修復に関与する多くのウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、環状ヌクレオチド生成シクラーゼ、およびA/B/YファミリーのDNAポリメラーゼと構造的に類似しています。真核生物の複製において、プライマーゼはPol αと複合体を形成します。[35]

DNA複製プロセスでは、複数のDNAポリメラーゼが異なる役割を担います。大腸菌では、DNAポリメラーゼIIIがDNA複製を主に担うポリメラーゼ酵素です。複製フォークで非常に高いプロセッシビティを示す複製複合体を形成し、複製サイクル全体を通してそのままの状態を保ちます。対照的に、DNAポリメラーゼIはRNAプライマーをDNAに置換する酵素です。DNAポリメラーゼIは、ポリメラーゼ活性に加えて5’-3’エキソヌクレアーゼ活性も持ち、ニックトランスレーションと呼ばれるプロセスで、エキソヌクレアーゼ活性を用いて、DNA鎖を後方に伸長させながら、その前方にあるRNAプライマーを分解します。DNAポリメラーゼIは、DNA複製における主な機能が、少数の非常に長いDNA領域ではなく、多数の短いDNA領域を作成することであるため、DNAポリメラーゼIIIよりもプロセッシビティははるかに低いです。[要出典]

真核生物では、低プロセシビティ酵素であるPol αはプライマーゼと複合体を形成するため、複製の開始を助けます。[36] 真核生物では、リーディング鎖合成はPol εによって行われると考えられていますが、この見解は最近異議を唱えられ、Pol δの役割が示唆されています。[37] プライマーの除去はPol δによって完了しますが[38]、複製中のDNAの修復はPol εによって完了します

DNA合成が続くと、元のDNA鎖は泡の両側でほどけ続け、2つの突起を持つ複製フォークを形成します。環状染色体上に単一の複製起点を持つ細菌では、このプロセスによって「シータ構造」（ギリシャ文字のシータ：θに似ている）が形成されます。対照的に、真核生物はより長い線状染色体を持ち、これらの中の複数の起点から複製を開始します。[39]

複製フォーク

複製フォークの図。a
：鋳型、b：リーディング鎖、c：ラギング鎖、d：複製フォーク、e：プライマー、f：岡崎断片
DNA複製フォークには多くの酵素が関与しています

複製フォークは、DNA複製中に長いらせん状のDNA内に形成される構造です。これは、DNA鎖をらせん状に結合させている水素結合を切断するヘリカーゼと呼ばれる酵素によって生成されます。結果として得られる構造は、それぞれが1本のDNA鎖からなる2つの分岐した「突起」を持ちます。これらの2本の鎖は、DNAポリメラーゼが相補的なヌクレオチドを鋳型に適合させることで生成されるリーディング鎖とラギング鎖の鋳型として機能します。これらの鋳型は、正確にはリーディング鎖鋳型とラギング鎖鋳型と呼ばれます。[要出典]

DNAはDNAポリメラーゼによって3'から5'方向に読み取られ、新しい鎖は5'から3'方向に合成されます。複製フォークではリーディング鎖とラギング鎖の鋳型が反対方向に向いているため、大きな課題は、成長中の複製フォークの方向とは逆の方向にある新しいラギング鎖DNAの合成をどのように達成するかです。[要出典]

リーディング鎖

リーディング鎖は、成長中の複製フォークと同じ方向に合成される新しいDNA鎖です。この種のDNA複製は連続的です。[要出典]

ラギング鎖

ラギング鎖とは、合成方向が成長中の複製フォークの方向と逆である新しいDNA鎖です。その方向のため、ラギング鎖の複製はリーディング鎖の複製に比べて複雑です。その結果、この鎖上のDNAポリメラーゼは、他の鎖よりも「遅れて」いるように見えます。[要出典]

ラギング鎖は短く分離されたセグメントとして合成されます。ラギング鎖テンプレート上で、プライマーゼはテンプレートDNAを「読み取り」、短い相補的RNAプライマーの合成を開始します。DNAポリメラーゼはプライミングされたセグメントを伸長させ、岡崎フラグメントを形成します。その後、RNAプライマーは除去され、DNAに置き換えられ、DNAフラグメントはDNAリガーゼによって結合されます。[要出典]

複製フォークにおけるダイナミクス

組み立てられたヒトDNAクランプ、タンパク質PCNAの三量体

いずれの場合も、ヘリカーゼは複製されるDNAの1本鎖のみを巻き付ける6つのポリペプチドで構成されています。2つのポリメラーゼはヘリカーゼ六量体に結合しています。真核生物ではヘリカーゼはリーディング鎖を巻き付け、原核生物ではラギング鎖を巻き付けます。[40]

ヘリカーゼが複製フォークでDNAをほどくと、その先のDNAは回転を強いられます。このプロセスの結果、前方のDNAにねじれが蓄積されます。[41]この蓄積により、最終的に複製フォークを停止させるねじれ荷重が発生します。トポイソメラーゼは、DNA鎖を一時的に切断し、DNAヘリックスの2本の鎖をほどくことによって引き起こされる張力を軽減する酵素です。トポイソメラーゼ（DNAジャイレースを含む）は、DNAヘリックスに負のスーパーコイルを追加することでこれを実現します。 [42]

むき出しの一本鎖DNAは、二次構造を形成するために折り畳まれる傾向があります。これらの構造はDNAポリメラーゼの動きを妨げる可能性があります。これを防ぐために、一本鎖結合タンパク質は、 2本目の鎖が合成されるまでDNAに結合し、二次構造の形成を防ぎます。[43]

二本鎖DNAは、遺伝子発現の制御に重要な役割を果たすヒストンの周りに巻かれているため、複製されたDNAは元のDNAと同じ場所でヒストンの周りに巻かれなければなりません。[44]これを確実にするために、ヒストンシャペロンは複製される前にクロマチンを分解し、ヒストンを正しい場所に置き換えます。この再構成のいくつかのステップは、やや推測的です。[45]

クランプタンパク質はDNA上でスライディングクランプとして機能し、DNAポリメラーゼが鋳型に結合して複製を助けます。クランプの内面はDNAを通すのに役立ちます。ポリメラーゼが鋳型の末端に到達するか、二本鎖DNAを検出すると、スライディングクランプの構造変化が起こり、DNAポリメラーゼが解放されます。クランプローディングタンパク質は、鋳型とRNAプライマーの接合部を認識し、最初にクランプをロードするために使用されます。[9] :274-5

DNA複製タンパク質

複製フォークでは、多くの複製酵素がDNA上に集合して、レプリソームと呼ばれる複雑な分子機械を形成します。以下は、レプリソームに関与する主要なDNA複製酵素のリストです。[46]

酵素 DNA複製における機能
DNAヘリカーゼ ヘリックス不安定化酵素としても知られています。ヘリカーゼは、トポイソメラーゼの後ろにある 複製フォークでDNAの2本の鎖を分離します。
DNAポリメラーゼ DNA複製中に、5'から3'方向へのヌクレオチド基質のDNAへの付加を触媒する酵素。また、校正とエラー訂正も行います。DNAポリメラーゼには多くの種類があり、それぞれが異なる種類の細胞で異なる機能を果たします。
DNAクランプ 伸長中のDNAポリメラーゼがDNA親鎖から解離するのを防ぐタンパク質。
一本鎖DNA結合タンパク質 一本鎖DNAに結合し、DNAヘリカーゼによってDNA二重らせんがほどかれた後、DNA二重らせんが再アニーリングするのを防ぎ、鎖の分離を維持し、新しい鎖の合成を促進します。
トポイソメラーゼ DNAのスーパーコイル構造を緩和します。
DNAジャイレース DNAヘリカーゼによるほどきの負担を軽減します。これはトポイソメラーゼの特定の種類です。
DNAリガーゼ 半保存鎖を再アニールし、ラギング鎖の 岡崎フラグメントを結合します
プライマーゼ DNAポリメラーゼが新しいDNA鎖の合成を開始するためのRNA（またはDNA）の開始点を提供します。
テロメラーゼ 真核生物の染色体の末端に反復ヌクレオチド配列を付加することにより、テロメアDNAを延長します。これにより、生殖細胞と幹細胞は細胞分裂のヘイフリック限界を回避できます。 [47]

光ピンセットと磁気ピンセットを使用したin vitro単分子実験では、レプリソーム酵素（ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、および一本鎖DNA結合タンパク質）とDNA複製フォークとの間の相乗的な相互作用が、 DNAの巻き戻しとDNA複製を促進することが。 [13]これらの結果は、相乗的な相互作用とその安定性を考慮した速度論モデルの開発につながっています。 [13]

複製機構

大腸菌レプリソーム。注目すべきことに、ラギング鎖上のDNAはループを形成します。レプリソームの正確な構造は十分に解明されていません

複製機構は、DNA複製に関与し、鋳型ssDNA上に現れる因子で構成されています。複製機構には、プリモソーム（複製酵素、DNAポリメラーゼ、DNAヘリカーゼ、DNAクランプ、DNAトポイソメラーゼ）、および複製タンパク質（例：一本鎖DNA結合タンパク質（SSB））が含まれます。複製機構では、これらの構成要素が協調して機能します。ほとんどの細菌では、DNA複製に関与するすべての因子が複製フォーク上に存在し、複合体はDNA複製中、フォーク上に留まります。複製機構はレプリソームまたはDNA複製システムとも呼ばれます。これらの用語は、複製フォーク上に存在するタンパク質の総称です。真核生物および一部の細菌細胞では、レプリソームは形成されません。[要出典]

別の図では、DNA工場は映写機に似ており、DNAは映写機に絶えず流れ込む映画フィルムのようなものです。複製工場モデルでは、リーディング鎖とラギング鎖の両方のDNAヘリカーゼがテンプレートDNAにロードされた後、ヘリカーゼはDNAに沿って互いに侵入します。ヘリカーゼは複製プロセスの残りの間、結合したままになります。ピーター・マイスターらは、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きDNAポリメラーゼαをモニタリングすることにより、出芽酵母の複製部位を直接観察しました。彼らは、複製起点から対称的に離れたタグ付き遺伝子座のペアのDNA複製を検出し、ペア間の距離が時間の経過とともに著しく減少することを発見しました。[48]この発見は、DNA複製のメカニズムがDNA工場に付随することを示唆しています。つまり、複製起点に複製工場のペアがロードされ、工場は互いに結合します。また、テンプレートDNAが工場に移動し、テンプレートssDNAと新しいDNAが押し出されます。マイスターの発見は、複製工場モデルの最初の直接的な証拠です。その後の研究で、多くの真核細胞ではDNAヘリカーゼが二量体を形成し、細菌の複製装置はDNA合成中に核内の単一の場所に留まることが示されました。[49]

複製工場は姉妹染色分体を解きほぐします。この解きほぐしは、DNA複製後に染色分体を娘細胞に分配するために不可欠です。DNA複製後の姉妹染色分体はコヒーシンリングによって互いに結合しているため、DNA複製において解きほぐしが行われる唯一の機会となります。複製装置を複製工場として固定することで、DNA複製の成功率を向上させることができます。複製フォークが染色体内で自由に移動すると、核の連鎖が悪化し、有糸分裂の分離が妨げられます。[48]

終結

真核生物は、染色体の複数の地点で DNA 複製を開始するため、複製フォークは染色体の多くの地点で出会い、終了する。真核生物は線状染色体を持っているため、DNA 複製は染色体の末端まで到達できない。この問題により、各複製サイクルで染色体の末端から DNA が失われる。 テロメアは末端に近い反復 DNA 領域であり、この短縮による遺伝子の損失を防ぐのに役立つ。テロメアの短縮は、体細胞では正常な過程である。これにより、娘 DNA 染色体のテロメアが短くなる。その結果、細胞は DNA の損失によってそれ以上の分裂ができなくなるまで、一定回数しか分裂できない。(これはヘイフリック限界として知られている。) DNA を次の世代に渡す生殖細胞株内では、テロメラーゼがテロメア領域の反復配列を延長して分解を防ぐ。テロメラーゼは体細胞で誤って活性化することがあり、場合によっては癌の形成につながる。テロメラーゼ活性の増加は、癌の特徴の一つです。[50]

複製終結には、DNA複製フォークの進行が停止または阻害される必要があります。特定の遺伝子座での複製終結は、2つの要素間の相互作用を伴います。(1) DNA内の終結部位配列、および(2) この配列に結合してDNA複製を物理的に停止させるタンパク質です。様々な細菌種において、これはDNA複製終結部位結合タンパク質、またはTerタンパク質と呼ばれています。[51]

細菌は環状染色体を持っているため、複製の終結は、2つの複製フォークが親染色体の反対側の端で互いに出会ったときに起こります。大腸菌は、 Tusタンパク質によって結合されると、複製フォークの一方向のみが通過できるようにする終結配列を使用して、このプロセスを制御します。その結果、複製フォークは常に染色体の終結領域内で出会うように制限されます。[52]

制御

真核細胞の細胞周期

真核生物

真核生物において、DNA複製は細胞周期の枠組みの中で制御されている。細胞が成長し分裂するにつれて、細胞周期の各段階を経て進行する。DNA複製はS期（合成期）に行われる。真核細胞における細胞周期の進行は、細胞周期チェックポイントによって制御されている。チェックポイントの進行は、サイクリンやサイクリン依存性キナーゼといった様々なタンパク質間の複雑な相互作用によって制御されている。[53]細菌とは異なり、真核生物のDNAは核内で複製される。[54]

G1/Sチェックポイント（制限チェックポイント）は、真核細胞がDNA複製とそれに続く分裂のプロセスに入るかどうかを制御します。このチェックポイントを通過しない細胞はG0期に留まり、DNAを複製しません。[要出典]

DNAが「G1/S」テストを通過すると、細胞周期ごとに1回しかコピーされません。Mcm複合体が複製開始点から離れると、複製開始点複合体は解体されます。複製開始点サブユニットが再活性化されるまで、新しいMcm複合体は複製開始点にロードできないため、同じ細胞周期で1つの複製開始点を2回使用することはできません。[32]

S期初期におけるS-Cdkの活性化は、個々の複製開始点複合体構成要素の破壊または阻害を促進し、即時の再組み立てを防ぎます。SおよびM-Cdkは、S期が完了した後も複製開始点複合体の組み立てを阻害し続け、有糸分裂後期にすべてのCdk活性が低下するまで、再び組み立てが行われないようにします。[32]

出芽酵母では、複製前複合体構成因子のCdk依存性リン酸化によって組み立てが阻害されます。S期の開始時に、Cdk1によるCdc6のリン酸化は、Cdc6がSCF ユビキチンタンパク質リガーゼに結合し、Cdc6のタンパク質分解を引き起こします。Mcmタンパク質のCdk依存性リン酸化は、S期中にCdt1とともに核外への輸送を促進し、単一細胞周期中に複製起点に新しいMcm複合体が積み込まれるのを防ぎます。複製起点複製複合体のCdkリン酸化は、複製前複合体の組み立ても阻害します。これらの3つのメカニズムのいずれかが単独で存在することで、複製前複合体の組み立てを阻害するのに十分です。しかし、同じ細胞内で3つのタンパク質すべてが変異すると、1つの細胞周期内で多くの複製起点で再開始が引き起こされます。[32] [55]

動物細胞において、タンパク質ジェミニンは複製前複合体の組み立てにおける重要な阻害剤です。ジェミニンはCdt1に結合し、複製起点認識複合体への結合を阻害します。G1期には、APCによってジェミニンのレベルが低く抑えられ、APCはジェミニンをユビキチン化して分解の標的とします。ジェミニンが破壊されると、Cdt1が放出され、複製前複合体の組み立てにおいて機能できるようになります。G1期の終わりには、APCは不活性化され、ジェミニンが蓄積してCdt1に結合できるようになります。[32]

葉緑体とミトコンドリアのゲノムの複製は、細胞周期とは独立して、Dループ複製のプロセスを通じて行われます。[要出典] [56]

複製の焦点

脊椎動物細胞では、複製部位は複製フォーカスと呼ばれる位置に集中します。[48]複製部位は、娘鎖と複製酵素を免疫染色し、GFPタグ付き複製因子をモニタリングすることで検出できます。これらの方法により、細胞分裂のS期にさまざまなサイズと位置の複製フォーカスが出現し、核あたりの数はゲノム複製フォークの数よりもはるかに少ないことがわかりました。

P. Heunら[48] （2001）は、出芽酵母細胞におけるGFPタグ付き複製フォーカスを追跡し、複製起点がG1期とS期では常に移動し、S期ではその動態が大幅に減少することを明らかにしました。[48]従来、複製部位は核マトリックスまたはラミンによって染色体の空間構造上に固定されていました。Heunの結果は従来の概念を否定し、出芽酵母にはラミンがないこと、そして複製起点が自己集合して複製フォーカスを形成することを裏付けています。[要出典]

空間的および時間的に制御された複製起点の発火によって、複製フォーカスの形成が制御されます。DA Jacksonら(1998)は、哺乳類細胞において隣接する起点が同時に発火することを明らかにし[48] 。複製部位の空間的な並置は、複製フォークのクラスター化をもたらします。クラスター化は、停止した複製フォークを救済し、複製フォークの正常な進行を促進します。複製フォークの進行は、タンパク質やDNAに強く結合する複合体との衝突、dNTPの欠乏、鋳型DNAのニックなど、多くの要因によって阻害されます。複製フォークが行き詰まり、行き詰まったフォークの残りの配列がコピーされない場合、娘鎖は複製されていない部位にニックができます。片方の親鎖の複製されていない部位は、もう一方の鎖を一緒に保持しますが、娘鎖は一緒に保持しません。したがって、結果として生じる姉妹染色分体は互いに分離できず、2つの娘細胞に分裂できません隣接する複製起点が発火し、一方の起点からのフォークが停止すると、もう一方の起点からのフォークが停止したフォークの反対方向にアクセスし、複製されていない部位を複製します。救済の他のメカニズムとして、通常のDNA複製では過剰な複製起点が発火しない休眠中の複製起点の適用があります。[要出典]

細菌

Damは複製後にGATC部位のアデニンをメチル化します

ほとんどの細菌は明確に定義された細胞周期を経ず、DNAを継続的に複製します。急速な増殖期には、複数の複製ラウンドが同時に発生する可能性があります。[57]最もよく特徴づけられている細菌である大腸菌 では、DNA複製は、複製開始配列のヘミメチル化と隔離、アデノシン三リン酸（ATP）とアデノシン二リン酸（ADP）の比率、タンパク質DnaAのレベルなど、いくつかのメカニズムによって制御されています。これらすべてが、開始タンパク質の複製開始配列への結合を制御します。[58]

大腸菌はGATC DNA配列を メチル化するため、DNA合成によってヘミメチル化配列が生成されます。このヘミメチル化DNAはタンパク質SeqAによって認識され、SeqAは複製開始配列に結合して隔離します。さらに、DnaA（複製の開始に必要）はヘミメチル化DNAへの結合が弱くなります。その結果、新たに複製された複製開始点は、すぐに次のDNA複製ラウンドを開始することができなくなります。[59]

細胞が栄養豊富な培地中にあるとATPが蓄積し、細胞が特定のサイズに達するとDNA複製が開始されます。ATPはADPと競合してDnaAに結合し、DnaA-ATP複合体は複製を開始することができます。DNA複製には一定数のDnaAタンパク質も必要です。複製起点がコピーされるたびに、DnaAの結合部位の数が倍増するため、次の複製開始を可能にするにはより多くのDnaAの合成が必要になります。[要出典]

大腸菌などの増殖の速い細菌では、染色体の複製は細胞分裂よりも時間がかかります。細菌は、前の複製が終了する前に新しい複製ラウンドを開始することでこれを解決します。[60]新しい複製ラウンドは、分裂細胞の2世代後に生まれる細胞の染色体を形成します。このメカニズムにより、重複した複製サイクルが作成されます。

DNA複製の問題

複製ストレス後の相同組換えによる複製フォークの再開
停止した複製フォークにおけるヌクレオソーム再構成の欠陥によるエピジェネティックな結果

複製ストレスに寄与するイベントは数多くあり、以下を含みます。[61]

ポリメラーゼ連鎖反応

研究者は一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて試験管内でDNAを複製します。PCRでは、一対のプライマーを用いて鋳型DNAの標的領域を連結し、耐熱性DNAポリメラーゼを用いてこれらのプライマーから各方向にパートナー鎖を重合します。このプロセスを複数サイクル繰り返すことで、標的DNA領域が増幅されます。各サイクルの開始時に、鋳型とプライマーの混合物が加熱され、新しく合成された分子と鋳型が分離されます。その後、混合物が冷却されると、これらは両方とも新しいプライマーのアニーリングのための鋳型となり、ポリメラーゼはこれらから伸長します。その結果、標的領域のコピー数は各サイクルで倍増し、指数関数的に増加します。[62]

参照

ウィキメディア・コモンズには、DNA複製に関連するメディアがあります
ウィキバーシティには、DNAに関する学習リソースがあります#DNA_Replication

注釈

  1. ^ このプロセスのエネルギー論は、合成の方向性を説明するのにも役立つかもしれません。DNAが3'から5'方向に合成される場合、このプロセスに必要なエネルギーは、遊離ヌクレオチドではなく、成長中の鎖の5'末端から供給されます。問題は、高エネルギー三リン酸が成長中の鎖上にあり、遊離ヌクレオチド上にない場合、ミスマッチな末端ヌクレオチドを除去することによる校正が困難になることです。ヌクレオチドが追加されると、三リン酸は失われ、新しいヌクレオチドと鎖の残りの部分の間の骨格に1つのリン酸が残ります追加されたヌクレオチドが不一致だった場合、除去すると、DNA鎖は「成長中の鎖」の末端で高エネルギー三リン酸ではなく一リン酸によって終結します。その結果、鎖は動かなくなり、それ以上成長できなくなります。実際には、各段階で加水分解される高エネルギー三リン酸は、重合鎖ではなく遊離ヌクレオチドに由来するため、この問題は存在しません。

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