ノースウェスタンブロット

ノースウェスタンブロットはノースウェスタンアッセイとも呼ばれ、ウェスタンブロットとノーザンブロットを組み合わせた分析技術で、分子生物学でRNAとタンパク質の相互作用を検出するために使用されます。関連技術であるウェスタンブロットは、ゲル電気泳動で分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、目的のタンパク質を検出するために使用されます。特定の標的タンパク質を含む膜上のバンドに沿って、色の沈殿物が集まります。ノーザンブロットは、目的のタンパク質を検出する代わりに、同様の膜上でRNA（または単離されたmRNA）を検出することにより遺伝子発現を調べるために使用される同様の分析技術です。ノースウェスタンブロットは2つの技術を組み合わせたもので、特に、同様のニトロセルロース膜上に固定化されたタンパク質と相互作用する標識RNAを識別します。

歴史

エドウィン・サザンは、 DNAの検出に使用される分析技術であるサザンブロット[ 1 ]を初めて開発しました。この技術は、ゲル電気泳動を使用する重要な分析方法であり、電界を使用し、荷電したDNA、RNA、またはタンパク質をサイズと電荷に基づいて電界を介して移動させます。[ 2 ] サザンブロットでは、分離されたDNA断片は検出のためにフィルター膜に転写されます。[ 1 ] 膜上でバンドが目に見えるようになり、特定の目的の分子と相関することで検出が行われます。[ 2 ] その後、さまざまな分子または分子間の相互作用を検出するために、同様の命名法で他の同様のブロッティング技術が作成されました。これらの技術には、ウエスタンブロット（タンパク質検出）、ノーザンブロット（RNA検出）、サウスウエスタンブロット（DNA-タンパク質相互作用検出）、イースタンブロット（翻訳後修飾検出）、ノースウエスタンブロット（RNA-タンパク質相互作用検出）などがあります。[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]

テクニックの詳細

ノースウェスタンブロット法では、 RNA結合タンパク質をゲル電気泳動によって分離します。この方法では、RNA結合タンパク質をサイズと電荷に基づいて分離します。個々のサンプルをアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル（通常はSDS-PAGE）にロードすることで、複数のサンプルを同時に分析することができます。[ 5 ]ゲル電気泳動が完了すると、ゲルとRNA結合タンパク質はニトロセルロース転写紙に転写されます。[ 7 ]

新しく転写されたブロットは、ブロッキング溶液に浸されます。ブロッキング緩衝液としては、脱脂乳やウシ血清アルブミンが一般的です。 [ 8 ] このブロッキング溶液は、一次抗体や二次抗体がニトロセルロース膜に非特異的に結合するのを防ぐのに役立ちます。ブロッキング溶液がブロットと十分な接触時間を得たら、特異的な競合RNAを適用し、室温でインキュベートします。この間に、競合RNAはブロット上にあるサンプル中のRNA結合タンパク質に結合します。このプロセス中のインキュベーション時間は、適用した競合RNAの濃度に応じて変化しますが、通常は1時間です。[ 9 ] インキュベーションが完了したら、ブロットは通常、1回の洗浄につき5分間、少なくとも3回洗浄され、溶液中のRNAが希釈されます。一般的な洗浄緩衝液には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または10％Tween 20溶液があります。[ 10 ] 洗浄が不適切または不十分だと、ブロットの現像の鮮明度が低下します。洗浄が完了したら、通常、ブロットはX線または類似のオートラジオグラフィー法で現像されます。[ 11 ]

アプリケーション

X線またはオートラジオグラフィーを用いてブロットを現像した後、その結果を分析・解釈することで、目的のRNA結合タンパク質のおおよそのサイズと濃度を決定し、タンパク質のさらなる研究を進めることができます。ブロット上のRNA結合タンパク質の位置と濃度は結果に影響を与える可能性があり、現像後にバンドが現れることもあります。これらのバンドは、研究者が目的のRNA結合タンパク質のサイズと濃度を決定するのに役立ちます。[ 12 ]タンパク質のおおよそのサイズがわかっている場合は、元のサンプルをクロマトグラフィー装置 にかけ、サイズ別に分離することができます。[ 13 ] さらに、タンパク質を単離した後、トリプシンで消化し、質量分析法を用いてペプチドの配列を決定し、特定のタンパク質の正体を特定することができます。[ 14 ]

メリットとデメリット

ノースウェスタンブロッティングの利点には、RNAに結合する特定のタンパク質の迅速な検出と、それらのタンパク質のおおよその分子量の評価が含まれます。[ 15 ] ノースウェスタンブロッティングは、同定されたタンパク質を低コストで検出することを可能にします。ブロットは、おおよその分子量の特定を可能にするため、研究の最初のステップとして一般的に使用されます。分子量が分かれば、クロマトグラフィーなどの他の方法による精製やさらなる研究が可能になります。ノースウェスタンブロッティングのもう一つの利点は、同族リガンドの発現ライブラリの構築に役立つことです。[ 16 ]

この技術の欠点として、RNA結合特性の弱いRNA-タンパク質相互作用は、この技術では検出できない可能性があることが挙げられます。[ 15 ] また、ブロッティングの手順には3～5時間かかります。手順が正しく行われないと、バックグラウンドが顕著になり、同定されたタンパク質のブロットが不鮮明になる可能性があります。さらに、タンパク質は分離されニトロセルロース膜に転写された後、元の状態に戻す必要があります。最後の欠点は、タンパク質が単一のポリペプチド、またはゲルマトリックス内で共移動する2つのサブユニットで構成されていなければならないことです。[ 17 ]

参照

プロトコル

若いイネ穂からのタンパク質-RNA相互作用のノースウェスタンブロット

RNA分離とノーザンブロット分析

タンパク質ブロッティング

参考文献

  1. ^ a bサザン、エドウィン・メラー（1975年11月5日）「ゲル電気泳動で分離されたDNA断片中の特定配列の検出」分子生物学ジャーナル98 ( 3): 503– 517. doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 . ISSN 0022-2836 . PMID 1195397. S2CID 20126741 .   
  2. ^ a bネルソン、コックス (2013).レーニンガー生化学原理. ニューヨーク: WHフリーマン・アンド・カンパニー. p. 179. ISBN 978-1-4641-0962-1。
  3. ^ Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538-539.
  4. ^ Kevil, CG, Walsh, L., Laroux, FS, Kalogeris, T., Grisham, MB, Alexander, JS (1997) 改良された迅速ノーザンプロトコル．生化学および生物理学研究会 238:277-279.
  5. ^ a b Rapley, R (2000).核酸プロトコルハンドブック. トトワ, ニュージャージー州: Humana Press Inc. p. 783. ISBN 978-0-89603-459-4。
  6. ^ Nicholas; Nelson (2013). 「北、南、それとも東？ブロッティング技術」 . Journal of Investigative Dermatology . 133 (e10): e10. doi : 10.1038/jid.2013.216 . PMID 23760052 . 
  7. ^ Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). 「顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子mRNAの3'非翻訳領域に特異的に結合するタンパク質の同定」 . Nucleic Acids Research . 25 (12): 2417– 2423. doi : 10.1093 / nar/25.12.2417 . PMC 146745. PMID 9171094 .  
  8. ^ Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, MB (1998年7月21日). 「アデノウイルス関連RNAの活性：RNA結合タンパク質の精製と特性解析」 . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 95 (15): 8514–9 . Bibcode : 1998PNAS...95.8514L . doi : 10.1073 / pnas.95.15.8514 . PMC 21107. PMID 9671709 .  
  9. ^ C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). 「ノースウェスタンブロットおよびサウスウェスタンブロットにおける非放射性検出法の使用」.タンパク質ブロッティングおよび検出. 分子生物学手法. 第536巻. pp.  441–9 . doi : 10.1007/978-1-59745-542-8_44 . ISBN 978-1-934115-73-2. PMID  19378081 .
  10. ^ Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (1995年5月). 「細胞質微小管に局在するマウスRNA結合タンパク質Spnr」 . The Journal of Cell Biology . 129 (4): 1023– 1032. doi : 10.1083 / jcb.129.4.1023 . PMC 2120489. PMID 7744952 .  
  11. ^ Stohlman, SA; RS Baric; GN Nelson; LH Soe; LM Welter; RJ Deans (1988). 「コロナウイルスリーダーRNAとヌクレオカプシドタンパク質の特異的相互作用」. Journal of Virology . 11. 62 (11): 4288–95 . doi : 10.1128/JVI.62.11.4288-4295.1988 . PMC 253863. PMID 2845141 .  
  12. ^ Thangasamy, Saminathan (2013年4月5日). 「若いイネ穂からのタンパク質-RNA相互作用のノースウェスタンブロット」 . Bio-Protocol . 3 (7): e625. doi : 10.21769/BioProtoc.625 . 2014年3月26日閲覧。
  13. ^ Perdew, Gary (2008年8月17日).遺伝子発現の制御：分子メカニズム. Springer. p. 129. ISBN 9781597452281。
  14. ^ゲイリー・H・パーデュー、ジャック・P・ヴァンデン・ヒューベル、ジェフリー・M・ピーターズ（2008年）『遺伝子発現の制御：分子メカニズム』シュプリンガー、129頁、ISBN 9781597452281。
  15. ^ a bスミス、クリストファー WJ (1998). RNA-タンパク質相互作用：実践的アプローチ. オックスフォード大学出版局. p. 187. ISBN 9780191591624。
  16. ^ウォルド、コーエン（1991年8月16日）.核酸研究と分子生物学の進歩. アカデミック・プレス. p. 186. ISBN 9780080863290。
  17. ^ニコルソン、アレン・W. (2001).リボヌクレアーゼ パートA：機能的役割と作用機序. アカデミック・プレス. p. 409. ISBN 9780080496917。
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