光音響顕微鏡

光音響イメージングの概略図

光音響顕微鏡法は、光音響効果に基づく画像化法であり、光音響トモグラフィーのサブセットです。光音響顕微鏡法は、組織における光吸収の結果として生じる局所的な温度上昇を利用します。ナノ秒パルスレーザービームを使用すると、組織は熱弾性膨張を起こし、その結果、高周波超音波トランスデューサーを使用して検出できる広帯域音波が放出されます。^{[ 1 ]}組織内の超音波散乱は光散乱よりも弱いため、光音響顕微鏡法は従来の顕微鏡法よりも深いところで高解像度の画像を得ることができます。さらに、光音響顕微鏡法は、そのスケーラビリティのために、生物医学画像化の分野で特に有用です。光焦点と音響焦点を調整することにより、所望の画像化深度に合わせて横方向解像度を最適化できます。^{[ 2 ]}

光音響信号

光音響顕微鏡の目的は、局所的な圧力上昇を見つけることです。この圧力上昇を使用して、次の式に従って 吸収係数を計算します。${\displaystyle p_{0}}$ ${\displaystyle \mu_{a}}$

${\displaystyle p_{0}=\Gamma \eta _{th}\mu _{a}F,}$

ここで、は熱に変換される光の割合、は局所的な光フルエンス（J/cm ²）、無次元グリュナイゼンパラメータは次のように定義されます。 ${\displaystyle \eta_{th}}$ ${\displaystyle F}$ ${\displaystyle \Gamma}$

${\displaystyle \Gamma ={\frac {\beta }{\kappa \rho C_{V}}},}$

ここで、は体積膨張係数（K ⁻¹）、は等温圧縮率（Pa ⁻¹）、は密度（kg/m ³）である。^{[ 3 ]}${\displaystyle \beta}$ ${\displaystyle \kappa }$ ${\displaystyle \rho }$

最初の圧力上昇に続いて、光音響波が媒体内を音速で伝播し、超音波トランスデューサーで検出できます。

画像再構成

光音響顕微鏡法の大きな利点の一つは、画像再構成の簡便性である。レーザーパルスが組織を軸方向に励起し、その結果生じる光音響波が超音波トランスデューサーによって検出される。トランスデューサーは、この機械エネルギーを電圧信号に変換し、アナログ-デジタルコンバーターで読み取って後処理に供する。各レーザーパルスの結果として、Aラインと呼ばれる1次元画像が形成される。Aラインをヒルベルト変換することで、深度符号化された情報が得られる。そして、2Dラスタースキャンによって生成された複数のAラインを組み合わせることで、3D光音響画像を形成することができる。^{[ 3 ]}

合成開口画像再構成

超音波トランスデューサの素子の遅延を変化させることで、音響レンズを通過するのと同様に超音波を集束させることができます。この遅延加算法によって、各焦点における信号を検出することができます。しかし、横方向分解能は、各素子の幅に依存した極角で発生するサイドローブの存在によって制限されます。^{[ 4 ]}

対比

光音響顕微鏡法を含む光音響イメージング法では、コントラストは光子励起に基づいており、したがって組織の光学特性によって決まります。電子が光子を吸収すると、より高いエネルギー状態に移動します。より低いエネルギーレベルに戻ると、電子は放射緩和または非放射緩和を起こします。放射緩和中、電子は光子の形でエネルギーを放出します。一方、非放射緩和中の電子はエネルギーを熱として放出します。その後、熱によって圧力上昇が誘発され、光音響波として伝播します。ほぼすべての分子が非放射緩和可能であるという事実により、光音響顕微鏡法は、広範囲の内因性および外因性の物質をイメージングできる可能性があります。対照的に、放射緩和が可能な分子は少ないため、1光子顕微鏡法や2光子顕微鏡法などの蛍光顕微鏡法には制限があります。^{[ 3 ]}現在の光音響顕微鏡の研究では、血液飽和度から癌の増殖率まで、身体に関する機能情報を得るために内因性および外因性の造影剤の両方を利用しています。

内因性造影剤

酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの吸収プロファイル

体内に自然に存在する分子である内因性造影剤は、非侵襲的に画像化できるため、光音響顕微鏡法において有用です。また、内因性造影剤は無毒性であり、研究対象となる組織の特性に影響を与えません。特に、内因性吸収体は、その吸収波長に基づいて分類することができます。^{[ 2 ]}

紫外線吸収剤

紫外線領域（λ = 180～400 nm）において、体内の主な吸収体はDNAとRNAです。紫外線光音響顕微鏡を用いることで、蛍光標識を用いることなく細胞核内のDNAとRNAを画像化することができます。がんはDNA複製の失敗と関連しているため、紫外線光音響顕微鏡はがんの早期発見に利用できる可能性があります。^{[ 5 ]}

可視光吸収剤

可視光吸収体（λ = 400～700 nm）には、酸化ヘモグロビン、脱酸化ヘモグロビン、メラニン、シトクロムcなどが含まれます。可視光光音響顕微鏡は、酸化ヘモグロビンと脱酸化ヘモグロビンの吸収プロファイルの違いを利用して、ヘモグロビン濃度と酸素飽和度を測定するのに特に有用です。その後、リアルタイム分析により血流速度と酸素代謝速度を測定することができます。^{[ 3 ]}さらに、皮膚がん細胞には高濃度のメラニンが存在するため、 光音響顕微鏡は悪性黒色腫の早期発見にも役立ちます。

近赤外線吸収剤

近赤外線吸収体（λ = 700～1400 nm）には、水、脂質、グルコースが含まれます。光音響法による血糖値の測定は糖尿病の治療に利用でき、血管内の脂質濃度の研究は動脈硬化の進行をモニタリングするために重要です。^{[ 2 ]}この波長では、吸収が低い代わりに組織への浸透が深くなりますが、脱酸素ヘモグロビンとヘモグロビンの濃度を定量化し比較することは依然として可能です。^{[ 6 ]}

外因性造影剤

内因性造影剤は非侵襲性で使用が簡便ですが、その固有の挙動と濃度によって制限があり、光吸収が弱い場合には特定のプロセスのモニタリングが困難になります。一方、外因性造影剤は、特定の対象分子に特異的に結合するように設計することができます。さらに、外因性造影剤の濃度を最適化することで、より大きな信号とより高いコントラストを得ることができます。選択的な結合により、外因性造影剤は特定の対象分子を標的としながら、得られる画像の質を向上させることができます。^{[ 3 ]}

有機染料

ICG -PEGやエバンスブルーなどの有機色素は、血管系の強調や腫瘍画像の鮮明化に用いられます。さらに、色素はサイズが小さい（3 nm以下）ため、体外に容易に濾過されます。^{[ 2 ]}

ナノ粒子

ナノ粒子は、化学的に不活性であり、腫瘍細胞を標的とする能力を持つことから、現在研究が進められています。これらの特性により、癌の増殖をモニタリングすることが可能となり、術中に癌を切除できる可能性も秘めています。しかし、ナノ粒子が臨床研究に適しているかどうかを判断するには、短期的な毒性作用に関するさらなる研究が必要です。^{[ 2 ]}金ナノ粒子は、画像誘導医療における造影剤として有望なことが示されています。AuNPは、その強い光吸収と調整可能な光吸収特性から、造影剤として広く使用されています。^{[ 7 ]}

蛍光タンパク質

蛍光タンパク質は蛍光顕微鏡イメージング用に開発されており、遺伝子コード化が可能であるため体内に投与する必要がないという点で独特である。光音響顕微鏡を用いることで、一般的な顕微鏡法の限界を超える深度で蛍光タンパク質を可視化することができる。^{[ 2 ]}組織における周波数依存的な音響減衰と高周波数域の減衰により、組織深部における光伝播の帯域幅が制限される。蛍光タンパク質は標的領域において光源として作用し、光減衰の制限を回避する。しかし、光拡散方程式によれば、蛍光タンパク質の有効性はフルエンス変化の低さによって制限される。^{[ 8 ]}

解決

OR-PAMを用いて532 nmで画像化したマウスの耳の血管

AR-PAMを用いて532 nmで画像化したマウスの耳の血管

405 nm を使用してメタノールで固定したヒト赤血球の光音響顕微鏡写真。

光音響顕微鏡は、超音波検出により従来の顕微鏡よりも優れた透過率を実現します。その結果、軸方向分解能は音響的に定義され、以下の式で決定されます。

${\displaystyle R_{axial}=0.88{\frac {\nu _{A}}{\Delta f_{A}}},}$

ここで、は媒質中の音速、は光音響信号の帯域幅である。システムの軸方向分解能は、帯域幅が光音響信号の帯域幅と一致する限り、より広い帯域幅の超音波トランスデューサーを使用することで向上させることができる。光音響顕微鏡の横方向分解能は、システムの光学焦点と音響焦点に依存する。光分解能光音響顕微鏡（OR-PAM）は音響焦点よりも狭い光学焦点を使用し、音響分解能光音響顕微鏡（AR-PAM）は光学焦点よりも狭い音響焦点を使用する。^{[ 9 ] [ 10 ]}${\displaystyle \nu_{A}}$ ${\displaystyle \Delta f_{A}}$

光学分解能光音響顕微鏡

OR-PAMは光学焦点がより狭いため、1mmまでの深さの準弾道範囲での画像化に適しています。 ^{[ 9 ]} OR-PAMの横方向解像度は次の式で決まります。

${\displaystyle R_{横,O}=0.51{\frac {\lambda _{O}}{NA_{O}}},}$

ここで、は光の波長、は光学対物レンズの開口数である。 ^{[ 2 ]} OR-PAMの横方向分解能は、レーザーパルスを短くし、レーザースポットをより狭く集光することで向上させることができる。OR-PAMシステムは通常、0.2～10μmの横方向分解能を達成できるため、OR-PAMは超解像イメージング法に分類される。 ${\displaystyle \lambda_{O}}$ ${\displaystyle NA_{O}}$

音響分解能光音響顕微鏡

1 mmを超え3 mmまでの深さでは、光散乱が大きくなるため、音響分解能光音響顕微鏡（AR-PAM）がより有用です。光拡散限界を超えると音響散乱ははるかに弱くなるため、これらの深さでより高い横方向分解能が得られるAR-PAMがより実用的になります。AR-PAMの横方向分解能は、以下の式で決定されます。

${\displaystyle R_{lateral,A}=0.71{\frac {\lambda _{A}}{NA_{A}}},}$

ここで、は光音響波の中心波長であり、は超音波トランスデューサの開口数である。^{[ 2 ]}したがって、超音波トランスデューサの中心周波数を高め、音響焦点をより狭くすることで、より高い横方向分解能を実現できる。AR-PAMシステムは通常、15～50μmの横方向分解能を達成できる。 ${\displaystyle \lambda_{A}}$ ${\displaystyle NA_{A}}$

暗視野共焦点光音響顕微鏡

PAMラスタースキャンパスの描写

暗視野共焦点光音響顕微鏡法は、弾道光を無視することで表面信号を低減します。この手法では、暗視野パルスレーザーと高NA超音波検出を用い、ファイバー出力端を集束超音波トランスデューサーと同軸に配置します。弾道光のフィルタリングは、従来の暗視野顕微鏡法で使用される不透明ディスクではなく、励起レーザービームの形状変化を利用します。一般的な再構成技術を用いて光音響信号を1本のAライン画像に変換し、ラスタースキャンによってBライン画像を生成します。^{[ 4 ]}

バイオメディカルアプリケーション

光音響顕微鏡法は、生物医学分野で幅広い応用が期待されています。光波長に基づいて様々な分子を画像化できるため、光音響顕微鏡法は非侵襲的に身体の機能情報を取得するために使用できます。血流動態や酸素代謝率を測定し、動脈硬化や腫瘍増殖の研究と相関させることができます。外因性薬剤を癌組織に結合させることで、画像のコントラストを高め、外科的切除を補助することができます。同様に、光音響顕微鏡法は、健常組織と比較して光吸収特性が異なるため、癌の早期診断にも有用です。^{[ 1 ]}

参照

• 光音響イメージング
• 光音響イメージングにおけるディープラーニング

参考文献

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