動的光散乱

2つのサンプルの仮想的な動的光散乱：上部に大きな粒子、下部に小さな粒子

動的光散乱（DLS ）は、懸濁液中の小さな粒子または溶液中のポリマーのサイズ分布プロファイルを決定するために使用できる物理学の技術です。^{[ 1 ]} DLSの範囲内で、時間的変動は通常、強度または光子自己相関関数（光子相関分光法– PCSまたは準弾性光散乱– QELSとも呼ばれる）を使用して分析されます。時間領域分析では、自己相関関数（ACF）は通常、遅延時間ゼロから減衰し、粒子が小さいためにダイナミクスが速いほど、散乱強度トレースの相関解除が速くなります。強度ACFはパワースペクトルのフーリエ変換であることが示されており、そのため、DLS測定はスペクトル領域でも同様に実行できます。^{[ 2 ] [ 3 ]} DLSは、濃縮ポリマー溶液などの複雑な流体の挙動を調べるためにも使用できます。

設定

単色光源（通常はレーザー）を偏光子を通して試料に照射します。散乱光は2つ目の偏光子を通過し、光電子増倍管によって集められ、スクリーン上に投影されます。これはスペックルパターンとして知られています（図1）。^{[ 4 ]}

図 1. 典型的なスペックルパターン。

溶液中のすべての分子に光が当たり、すべての分子が光をあらゆる方向に回折します。すべての分子からの回折光は、建設的に干渉する（明るい領域）か、破壊的に干渉する（暗い領域）かのいずれかになります。このプロセスは短い時間間隔で繰り返され、結果として得られるスペックルパターンのセットは、各スポットにおける光の強度を時間経過とともに比較する自己相関器によって分析されます。偏光子は2つの幾何学的構成で設置できます。1つは垂直/垂直（VV）構成で、2つ目の偏光子は主偏光子と同じ方向の光のみを通過させます。垂直/水平（VH）構成では、2つ目の偏光子は入射光と異なる方向の光のみを通過させます。

説明

光が小さな粒子に当たると、粒子が波長に比べて小さい限り（250 nm未満） 、光はあらゆる方向に散乱します（レイリー散乱） 。光源がレーザーで単色かつコヒーレントであっても、散乱強度は時間とともに変動します。この変動は懸濁液中の小さな粒子がブラウン運動をするためであり、溶液中の散乱体間の距離は時間とともに常に変化しています。この散乱光は周囲の粒子によって建設的干渉または破壊的干渉を受け、この強度変動の中に散乱体の運動の時間スケールに関する情報が含まれます。溶液からほこりやアーティファクトを除去するには、ろ過または遠心分離によるサンプル調製が重要です。

粒子の動的情報は、実験中に記録された強度トレースの自己相関から得られます。2次自己相関曲線は、強度トレースから以下のように生成されます。

${\displaystyle g^{2}(q;\tau )={\frac {\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}}$

ここで、g ² ( q ; τ )は特定の波数ベクトルqと遅延時間τにおける自己相関関数、Iは強度です。山括弧は期待値演算子を表し、一部の文献では大文字のEで表記されます。 ${\displaystyle \langle \cdot \rangle }$

遅延時間が短い場合、相関は高くなります。これは、粒子が初期状態から大きく移動する機会がないためです。そのため、非常に短い時間間隔で比較した場合、2 つの信号は本質的に変化しません。遅延時間が長くなると、相関は指数関数的に減少します。つまり、長い期間が経過すると、初期状態と最終状態の散乱強度に相関がなくなります。この指数関数的減少は、粒子の動き、具体的には拡散係数に関連しています。減少 (つまり、自己相関関数) を近似するために、仮定された分布の計算に基づく数値手法が使用されます。サンプルが単分散(均一) の場合、減少は単純な単一の指数関数です。Siegert の式は、2 次自己相関関数と 1 次自己相関関数g ¹ ( q ; τ )を次のように関連付けます。

${\displaystyle g^{2}(q;\tau )=1+\beta \left[g^{1}(q;\tau )\right]^{2}}$

ここで、合計の最初の項はベースライン値（≈1）に関連し、パラメータβは光散乱装置におけるレーザービームの形状と配置に依存する補正係数です。これは、光が集められるスペックルの数（スペックルパターンを参照）の逆数にほぼ等しくなります。レーザービームの焦点が小さいほど、スペックルパターンは粗くなり、検出器上のスペックルの数は少なくなりますが、2次自己相関は大きくなります。自己相関関数の最も重要な用途は、サイズ決定への使用です。

多重散乱

動的光散乱は、検出された各光子がサンプルによって正確に 1 回散乱されたことを意味する単一散乱イベントを測定することにより、柔らかい材料の動的特性に関する知見を提供します。原理的には、DLS 測定は検出器を任意の角度に配置して実行できます。最適な角度の選択は、濁度や粒子サイズなどのサンプル特性によって異なります。^{[ 5 ]}後方散乱検出 (例: 173° または 175°) は、大きな粒子を含む濁った高濃度サンプルに特に有効です。側方散乱検出 (90°) は、小さな粒子や透明なサンプルなどの散乱が弱いサンプルに推奨されます。最後に、前方散乱検出 (例: 13° または 15°) は、大きな粒子がほとんど含まれない小さな粒子を含むサンプルの検出に適しています。市販されている一部の DLS 機器では、連続透過率測定に基づいて角度を自動選択することもできます。

濁度範囲の下限では、キャビティ増幅散乱分光法^{[ 6 ]}が積分キャビティを用いて、準非散乱試料を通過する光子の経路を延長します。従来のDLS装置とは異なり、この方法は試料をあらゆる方向から等方的にプローブするため、角度に依存しません。

単一角度検出を使用する DLS 測定は最も普及した技術であるが、科学および産業関連の多くのシステムへの適用は、光子が検出される前にサンプルによって複数回散乱される多重散乱に頻繁に遭遇するため、制限されている。多重散乱からの寄与が無視できないシステムでは、正確な解釈が非常に困難になる。特に、より大きな粒子や屈折率コントラストの高い粒子の場合、この技術は極めて低い粒子濃度に制限され、その結果、さまざまなシステムが動的光散乱による調査から除外される。しかし、Schaetzel によって示されたように、^{[ 7 ]}相互相関アプローチを介して動的光散乱実験で多重散乱を抑制することが可能である。基本的な考え方は、動的光散乱実験で単一散乱光を分離し、多重散乱からの望ましくない寄与を抑制することである。相互相関光散乱のさまざまな実装が開発され、適用されている。現在、最も広く使用されている方式は、いわゆる3D動的光散乱法である。^{[ 8 ] [ 9 ]}同じ方法は、多重散乱の寄与に対する静的光散乱データの補正にも使用できる。^{[ 10 ]}あるいは、強い多重散乱の限界では、拡散波分光法と呼ばれる動的光散乱の変種を適用することができる。

データ分析

導入

自己相関データが生成されると、そこから「情報」を得るために様々な数学的アプローチを適用できます。粒子が衝突やイオン間の静電力によって相互作用しない場合、散乱の解析は容易になります。粒子間の衝突は希釈によって抑制でき、電荷効果は電気二重層を崩壊させる塩の使用によって低減できます。

最も単純なアプローチは、一次自己相関関数を単一の指数関数的減衰として扱うことです。これは単分散集団に適しています。

${\displaystyle \ g^{1}(q;\tau )=\exp(-\Gamma \tau )\,}$

ここで、Γは減衰率である。並進拡散係数D _{t は、}波数ベクトルqに応じて、単一の角度または角度範囲で導出される。

${\displaystyle \ \Gamma =q^{2}D_{t}\,}$

と

${\displaystyle \ q={\frac {4\pi n_{0}}{\lambda }}\sin \left({\frac {\theta }{2}}\right)}$

ここで、λは入射レーザーの波長、n ₀は溶媒の屈折率、θはサンプルセルに対する検出器の角度です。

溶媒の屈折率は光散乱において重要な役割を果たしており、ストークス・アインシュタインの式からストークス半径を計算する上で重要である。^{[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]}そのため、散乱媒体からの以前の屈折率データは、屈折計と呼ばれる専用機器で評価する必要がある。あるいは、屈折率測定モジュールを含むDLS機器では、この重要なパラメータを±0.5%以内で良好に推定することができ、これはDLSに必要な屈折率値についてISO 22412:2017 ^{[ 14 ] [ 15 ]}で定義されている精度である。媒体の屈折率に加えて、粒子の屈折率は、より大きな粒子サイズ（通常100 nm以上）を分析し、体積または個数で重み付けされたサイズ分布が必要な場合にのみ必要となる。このような場合、ミー散乱を適用するために、材料の屈折率と吸光度に関する事前の知識が必要である。^{[ 16 ] [ 17 ]}

システムの異方性と多分散性に応じて、 (Γ/ q ² ) vs. q ²のプロットは角度依存性を示す場合と示さない場合があります。小さな球形粒子は角度依存性を示さず、したがって異方性はありません。(Γ/ q ² ) vs. q ²のプロットは水平線になります。球以外の形状の粒子は異方性を示し、したがって (Γ/ q ² ) vs. q ²をプロットすると角度依存性が現れます。^{[ 18 ]}切片はいずれの場合も D _tになります。したがって、粒子サイズごとに最適な検出角度θがあります。高品質の分析は、常に複数の散乱角度で実行する必要があります (多角度 DLS)。これは、粒子サイズ分布が不明な多分散サンプルではさらに重要になります。特定の角度では、一部の粒子の散乱強度が他の粒子の弱い散乱信号を完全に圧倒し、その角度におけるデータ解析ではそれらの粒子が見えなくなります。固定角度でのみ動作するDLS装置は、一部の粒子に対してのみ良好な結果をもたらします。したがって、1つの検出角度のみを持つDLS装置で示される精度は、特定の粒子に対してのみ当てはまります。

D _{t は}、ストークス・アインシュタインの式を用いて球体の流体力学的半径を計算する際によく用いられます。動的光散乱によって決定されるサイズは、散乱体と同様に移動する球体のサイズであることに注意することが重要です。したがって、例えば散乱体がランダムコイルポリマーである場合、決定されたサイズは静的光散乱によって決定される回転半径と同じではありません。また、得られたサイズには、粒子と共に移動する他の分子や溶媒分子も含まれることを指摘しておくことも有用です。したがって、例えば界面活性剤層を含む金コロイドは、透過型電子顕微鏡（コントラストが低いため層が「見えない」 ）よりも動的光散乱（界面活性剤層を含む）によって大きく見えます

ほとんどの場合、サンプルは多分散です。したがって、自己相関関数は、集団内のそれぞれの種に対応する指数関数的減衰の合計となります。

${\displaystyle g^{1}(q;\tau )=\sum _{i=1}^{n}G_{i}(\Gamma _{i})\exp(-\Gamma _{i}\tau )=\int G(\Gamma )\exp(-\Gamma \tau )\,d\Gamma .}$

g ¹ ( q ; τ )のデータを取得し、上記の逆行列を導出してG (Γ)を抽出しようとする誘惑に駆られます。G (Γ) は各種からの相対散乱に比例するため、サイズ分布に関する情報を含んでいます。しかし、これは不良設定問題として知られています。以下に説明する方法（およびその他の方法）は、自己相関関数から可能な限り多くの有用な情報を抽出するために開発されました。

キュムラント法

最も一般的な方法の一つはキュムラント法であり、^{[ 19 ] [ 20 ]}上記の指数関数の合計に加えて、システムの 分散について以下のようにより多くの情報を得ることができる。

${\displaystyle \ g^{1}(q;\tau )=\exp \left(-{\bar {\Gamma }}\left(\tau -{\frac {\mu _{2}}{2!}}\tau ^{2}+{\frac {\mu _{3}}{3!}}\tau ^{3}+\cdots \right)\right)}$

ここで、Γは平均減衰率、μ ₂ / Γ ²は2次の多分散指数（または分散の指標）である。3次の多分散指数も導出できるが、これは系の粒子が高度に多分散である場合にのみ必要である。z平均並進拡散係数D _{z は、}波数ベクトルqに応じて、単一の角度または角度範囲で導出できる。

${\displaystyle \ {\bar {\Gamma }}=q^{2}D_{z}\,}$

キュムラント法はτが小さくG ( Γ )が十分に狭い場合に有効であることに注意する必要がある。^{[ 21 ]}べき級数展開において多くのパラメータを持つデータを過剰適合させると、μ2を含むすべてのパラメータの精度が低下するため、μ3_を超えるパラメータを使用することはめったにない。_[ 22 ^{]キュムラント法} は、以下の方法よりも実験ノイズの影響を受けにくい。 ${\displaystyle \scriptstyle {\bar {\Gamma }}}$

サイズ分布関数

粒径分布は自己相関関数を用いても得ることができる。しかし、多分散サンプルはキュムラント適合解析ではうまく分解されない。したがって、非負最小二乗法（NNLS）アルゴリズムとTikhonov 正則化などの正則化法の組み合わせは、多峰性サンプルを分解するために使用することができる。^{[ 16 ]} NNLS 最適化の重要な特徴は、特定の解を識別し、測定データと適合度の偏差を最小化するために使用される正則化項である。すべてのサンプルに適した理想的な正則化項はない。この項の形状によって、解が少数のピークを持つ一般的な広い分布を表すか、狭く離散的な集団に適合するかが決まります。あるいは、粒径分布の計算は CONTIN アルゴリズムを使用して実行されます。

CONTINアルゴリズム

自己相関関数を解析する別の方法として、Steven Provencherによって開発されたCONTINと呼ばれる逆ラプラス変換があります。^{[ 23 ] [ 24 ]} CONTIN解析は、キュムラント法では分解できない異分散系、多分散系、および多峰性系に最適です。2つの異なる粒子集団を分離する分解能は約5倍以上であり、2つの異なる集団間の相対強度の差は1:10 ^-5未満である必要があります。

最大エントロピー法

最大エントロピー法は、大きな発展の可能性を秘めた分析手法です。この手法は、分析用超遠心分離法による沈降速度データの定量化にも用いられます。最大エントロピー法は、フィッティングデータと実験データの偏差を最小化し、ひいてはフィッティングデータのχ ²を低下させるための複数の反復ステップを含みます。

非球形粒子の散乱

問題の粒子が球形でない場合、光の散乱は方向によって異なるため、回転運動も考慮する必要があります。ペコラによれば、回転ブラウン運動は、粒子が光学的異方性と幾何学的異方性の両方の条件を満たす場合に散乱に影響を与えます。^{[ 25 ]}棒状分子はこれらの条件を満たすため、並進拡散係数に加えて回転拡散係数を考慮する必要があります。最も簡潔な形では、この式は次のようになります。

${\displaystyle {\frac {A}{B}}={\frac {5}{4}}{\frac {4\mathrm {M} _{p}+2\mathrm {N} \mathrm {M} _{l}\mathrm {M} _{p}+\mathrm {M} _{l}}{\mathrm {M} _{p}-\mathrm {N} +\mathrm {M} _{l}}}}$

ここで、A / B は2 つの緩和モード (並進および回転) の比であり、M _{p に}は粒子の中心軸に垂直な軸に関する情報が含まれ、M _lには中心軸に平行な軸に関する情報が含まれます。

2007年、ピーター・R・ラングと彼のチームは、動的光散乱を用いて短い金ナノロッドの粒子長とアスペクト比を決定することを決定した。^{[ 26 ]}彼らは、試料を破壊せず、セットアップも比較的容易なことから、この手法を選択した。VVジオメトリにおいて、両方の緩和状態が観測され、両方の運動の拡散係数を用いて金ナノ粒子のアスペクト比が計算された。

アプリケーション

DLSは、タンパク質^{[ 27 ]}、ポリマー、ミセル^{[ 28 ]}、タンパク質ケージおよびウイルス様粒子^{[ 29 ] 、[ 30} ] 、小胞^{[ 31 ]} 、炭水化物、ナノ粒子^{[ 32 ] 、 [ 33 ]} 、生物細胞[34]、^{ゲル[ 35 ]など、様々な粒子のサイズを評価するために使用}されます。系のサイズが分散していない場合は、粒子の平均有効直径を測定できます。この測定値は、粒子コアのサイズ、表面構造のサイズ、粒子濃度、および媒体中のイオンの種類に依存します。

DLSは基本的に拡散粒子による散乱光強度の変動を測定するため、粒子の拡散係数を決定することができます。市販のDLSソフトウェアは通常、異なる直径における粒子集団を表示します。システムが単分散の場合、粒子集団は1つだけであるはずですが、多分散システムの場合は複数の粒子集団が表示されます。サンプル中に複数のサイズの粒子集団が存在する場合は、光子相関分光装置の場合はCONTIN分析、ドップラーシフト装置の場合はパワースペクトル法を適用する必要があります。

安定性研究はDLS（液体質量分析）を用いて簡便に行うことができます。試料を定期的にDLS測定することで、粒子の流体力学的半径が増加するかどうかを観察することで、粒子が時間の経過とともに凝集するかどうかを知ることができます。^{[ 32 ] [ 33 ]}粒子が凝集すると、より大きな半径を持つ粒子の集団が増加します。一部のDLS装置では、その場で温度を制御することで、温度依存性の安定性を分析できます。

参照

• 微分動的顕微鏡法
• 微分静的光散乱（DSLS）
• 拡散波分光法
• 拡散係数
• 蛍光相関分光法
• 干渉散乱顕微鏡
• 光散乱
• 多角度光散乱
• ナノ粒子追跡分析（NTA）
• タンパク質間相互作用
• 走査イオン閉塞検知
• 静的光散乱（SLS）
• 単一粒子消散散乱（SPES）
• ストークス半径

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外部リンク

• 溶液中のブラウン運動中の小さなビーズの半径を決定するためのDLS
• DLSを用いた粒子サイズ測定
• タンパク質、ポリマー、コロイド分散液の粒子サイズ特性評価のための動的光散乱
• 動的光散乱の理解、ワイアットテクノロジー