ポリプリン製逆フーグスティーン ヘアピン
逆フーグスティーン結合によって結合した2つのホモプリンドメインを示すPPRH構造

ポリプリン逆フーグスティーンヘアピン（PPRH）は、非修飾オリゴヌクレオチドであり、2つのポリプリンドメインを鏡像反復構造で有し、ペンタチミジン鎖によって連結された二本鎖DNAステムループ分子を形成します。2つのポリプリンドメインは分子内逆フーグスティーン結合によって相互作用し、この特異的なヘアピン構造を形成します。

プロパティ

テンプレートPPRHはdsDNAのテンプレート鎖に結合する。コーディングPPRHはdsDNAのコーディング鎖に結合する。

PPRHは、一本鎖または二本鎖DNAのポリピリミジン鎖にワトソン結合とクリック結合によって結合し、三本鎖DNA構造を形成する。PPRH三本鎖の形成は生理的pHで起こる。PPRHは標的dsDNAのホモプリン配列の鎖置換[ 1 ]を引き起こし、DNAの2本鎖を開く。PPRHには、i) DN ​​Aのテンプレート鎖に結合して転写を阻害するテンプレートPPRH [ 2 ]と、ii) DN​​Aのコーディング鎖に結合してスプライシングを変化させるコーディングPPRH [ 3 ]の2種類がある。どちらのタイプのPPRHも遺伝子発現を低下させる。PPRHは血清や細胞内で高い安定性を示し、免疫原性がないため、自然炎症反応を活性化しない。[ 4 ] PPRHにはオフターゲット効果がなく、肝毒性や腎毒性も示さない。[ 5 ]

アプリケーション

PPRHは遺伝子サイレンシングツールとして利用可能である[ 6 ]。三本鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはsiRNAとは異なるメカニズムで作用する。PPRHは標的に結合すると、選択された遺伝子のmRNAおよびタンパク質レベルを低下させることができる。これらの作用は、がん遺伝子治療戦略の一環として、代謝（DHFR）、増殖（mTOR）、DNAトポロジー（TOP1）、寿命と老化（テロメラーゼ）、アポトーシス（サービビン、BCL2）、転写因子および非薬物標的（c-MYC [ 7 ]およびk-Ras [ 8 ]）、プロトオンコゲン（MDM2）[ 9 ] 、複製ストレス（WEE1、CHK1）[ 10 ]、チミジル酸合成酵素（TYMS）[ 11 ]に関与する多数の遺伝子に対して試験管内試験で実証されている。これらの前臨床的原理は、抗アポトーシスサービビン遺伝子を用いて生体内で実証されている。 [ 12 ] PPRHは、MCF7乳がん細胞のCD47やマクロファージのSIRPαをサイレンシングすることで、がん免疫療法のツールとしても応用されています。 [ 13 ]また、ヒト腫瘍細胞のPD-1/PD-L1経路をサイレンシングすることでも応用されています。[ 14 ] [ 15 ] PPRHは、SARS-CoV-2などのウイルスのRNAと三重鎖を形成することでウイルス感染を検出するためのさまざまなデバイスのキャプチャプローブとしても使用できます。この技術は、三重鎖強化核酸検出アッセイ（TENADA）と呼ばれます。[ 16 ]

デザインと改良

野生型 PPRH: DNA ターゲット内のプリン中断の前にピリミジンを含む PPRH のバージョン。

PPRHは、ゲノム中のほぼあらゆる遺伝子に対して、目的遺伝子の配列中からポリピリミジン領域を検索することで設計できます。PPRHの各ドメインの最適な長さは20～30ヌクレオチドです。典型的なPPRHの全長は、25塩基のドメイン2つとリンキングループ用の5Tを考慮して55ヌクレオチドです。ポリピリミジン標的内にプリンの中断（最大3つ）がある場合、ヘアピン構造においてプリンの直前に相補塩基（ピリミジン）を配置することで、PPRH結合親和性は最大限に高まります[ 17 ]（野生型PPRH）。

ウェッジPPRH

ウェッジPPRH: 標的dsDNAの置換鎖の相補配列を保持する5'末端の延長部を持つ特定のタイプのPPRH

さらなる発展として、標的dsDNAの置換されたポリプリン鎖に相補的な配列をPPRHの5'側面に挿入することで鎖置換を安定化させ、さらなる結合と機能性を生み出すことができる。[ 17 ]

WEBツール

三重らせん標的DNA部位（TTS）は、ポリプリンから構成されるDNA配列であり、ゲノムDNAにおいて三重らせん構造（トリプレックス）を形成する能力を持つ。ヒトゲノム中の遺伝子および調節要素（例：転写因子結合部位、反復配列、G四重鎖モチーフ、SNP、非タンパク質コード調節DNA要素）に関連するPPRH配列を含む三重らせん形成標的DNA配列の同定および解析のための統合型WEBツールが公開されている（外部リンク参照）。[ 18 ] [ 19 ]

これらのツールは、生物学的に意味のあるゲノムポリプリン領域を検索し、PPRH のような天然のペアポリプリンドメインの生物学的役割を理解し、抗遺伝子治療の実験設計を最適化するために使用できます。

参考文献

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