タンパク質工学

タンパク質工学とは、非天然ポリペプチドの設計と生産を通じて、有用または価値の高いタンパク質を開発するプロセスであり、多くの場合、自然界に存在するアミノ酸配列を改変することによって行われます。 [ 1 ]これはまだ新しい分野であり、タンパク質の折り畳み構造の理解とタンパク質設計原理の認識に関する研究が盛んに行われています。これは、産業用触媒として多くの酵素の機能向上に利用されてきました。[ 2 ]また、製品およびサービスの市場であり、2017年までに1680億ドルの市場規模に達すると推定されています。[ 3 ]

タンパク質工学には、一般的に合理的タンパク質設計と指向性進化という2つの戦略があります。これらの手法は相互に排他的ではなく、研究者は多くの場合両方を適用します。将来的には、タンパク質の構造と機能に関するより詳細な知識と、ハイスループットスクリーニングの進歩により、タンパク質工学の能力は大幅に向上する可能性があります。最終的には、遺伝コードに新規アミノ酸をコード化できる拡張遺伝コードなどの新しい手法により、非天然アミノ酸さえも組み込むことができるようになるかもしれません。医療や産業用バイオプロセスなど、多くの分野への応用は広範かつ多岐にわたります。

アプローチ

合理的な設計

合理的なタンパク質設計において、科学者はタンパク質の構造と機能に関する詳細な知識を用いて、望ましい変化をもたらします。一般的に、部位特異的変異誘発法が十分に開発されているため、この方法は安価で技術的に容易であるという利点があります。しかし、大きな欠点は、タンパク質の詳細な構造情報がしばしば入手できないこと、そしてたとえ入手できたとしても、構造情報はタンパク質構造の静的な画像しか提供しないことが多いため、様々な変異の影響を予測することが非常に困難であることです。しかし、Folding@homeやFolditなどのプログラムは、クラウドソーシング技術を利用してタンパク質のフォールディングモチーフに関する知見を得ています。[ 4 ]

計算タンパク質設計アルゴリズムは、事前に指定された標的構造に折り畳まれた際にエネルギー効率が低い新規アミノ酸配列を同定することを目指します。探索すべき配列コンフォメーション空間は広大ですが、計算タンパク質設計における最も困難な要件は、最適な配列と類似の準最適な配列を区別できる、高速かつ正確なエネルギー関数です。

多重配列アライメント

タンパク質の構造情報がない場合でも、配列解析はタンパク質に関する情報を解明する上で有用であることが多い。これらの手法では、標的タンパク質配列を他の関連タンパク質配列とアライメントする。このアライメントにより、種間で保存されているアミノ酸やタンパク質の機能に重要なアミノ酸を明らかにすることができる。これらの解析は、変異の標的部位となり得るホットスポットアミノ酸を特定する際に役立つ。多重配列アライメントでは、PREFAB、SABMARK、OXBENCH、IRMBASE、BALIBASEなどのデータベースを用いて、標的タンパク質配列と既知の配列を相互参照する。多重配列アライメント手法は以下の通りである。[ 5 ]

この手法は、まずk-tuple法またはNeedleman–Wunsch法を用いて配列のペアワイズアライメントを行う。これらの手法は、配列ペア間の類似度を表す行列を計算する。類似度スコアは距離スコアに変換され、これを用いて近傍結合法を用いてガイドツリーを作成する。このガイドツリーを用いて、多重配列アライメントを作成する。[ 5 ]

クラスタルオメガ

この手法は、k-tuple法を用いることで最大190,000配列のアライメントが可能です。次に、mBed法とk -means法を用いて配列をクラスタリングします。次に、HH alignパッケージで使用されるUPGMA法を用いてガイドツリーを構築します。このガイドツリーは、多重配列アライメントを生成するために使用されます。[ 5 ]

マフト

この方法は、高速フーリエ変換（FFT）を用いてアミノ酸配列を各アミノ酸残基の体積と極性の値からなる配列に変換する。この新しい配列は相同領域を見つけるために使用される。[ 5 ]

K-アライン

この方法は、Wu-Manber近似文字列マッチングアルゴリズムを利用して、複数の配列アライメントを生成する。[ 5 ]

対数期待値による多重配列比較（MUSCLE）

この方法は、Kmer距離とKimura距離を利用して多重配列アライメントを生成する。[ 5 ]

Tコーヒー

この手法は、アライメントの進化にツリーベースの一貫性目的関数を利用する。この手法は、Clustal Wよりも5～10%精度が高いことが示されている。[ 5 ]

共進化分析

共進化解析は、相関変異、共変動、または共置換とも呼ばれます。このタイプの合理的設計は、進化的に相互作用する遺伝子座における相互の進化的変化を伴います。一般的に、この手法は、標的配列について精選された多重配列アライメントの作成から始まります。次に、このアライメントは、ギャップの大きい配列や配列相同性の低い配列を除去する手動による改良にかけられます。このステップにより、アライメントの品質が向上します。次に、手動で処理されたアライメントは、異なる相関変異アルゴリズムを用いたさらなる共進化測定に利用されます。これらのアルゴリズムは、共進化スコアリングマトリックスを生成します。このマトリックスは、様々な有意性検定を適用することでフィルタリングされ、有意な共進化値を抽出し、バックグラウンドノイズを除去します。共進化測定はさらに評価され、その性能と厳密性を評価します。最後に、この共進化解析の結果は実験的に検証されます。[ 5 ]

構造予測

タンパク質の de novo生成は、既存のタンパク質構造に関する知識から恩恵を受けます。この既存のタンパク質構造に関する知識は、新しいタンパク質構造の予測に役立ちます。タンパク質構造予測の手法は、 ab initio法、フラグメントベース法、ホモロジーモデリング、タンパク質スレッディングの4つのクラスに分類されます。 [ 5 ]

アブイニシオ

これらの手法は、テンプレートの構造情報を一切用いない自由モデリングを伴う。アブイニシオ法は、タンパク質の自由エネルギーの最小値に対応する天然構造の予測を目的としている。アブイニシオ法の例として、AMBER、GROMOS、GROMACS、CHARMM、OPLS、ENCEPP12などが挙げられる。 アブイニシオ法の一般的な手順は、対象となるタンパク質の幾何学的表現から始まる。次に、タンパク質のポテンシャルエネルギー関数モデルが開発される。このモデルは、分子力学ポテンシャルまたはタンパク質構造由来のポテンシャル関数のいずれかを用いて作成することができる。ポテンシャルモデルの開発後、分子動力学シミュレーション、モンテカルロシミュレーション、遺伝的アルゴリズムなどのエネルギー探索手法がタンパク質に適用される。[ 5 ]

フラグメントベース

これらの手法は、構造に関するデータベース情報を用いて、作成されたタンパク質配列と相同構造をマッチングさせます。これらの相同構造は、スコアリングと最適化の手順を用いてコンパクトな構造にアセンブルされ、最小のポテンシャルエネルギースコアを達成することを目指します。フラグメント情報のウェブサーバーとしては、I-TASSER、ROSETTA、ROSETTA @ home、FRAGFOLD、CABS fold、PROFESY、CREF、QUARK、UNDERTAKER、HMM、ANGLORなどがあります。[ 5 ]：72

ホモロジーモデリング

これらの手法はタンパク質の相同性に基づいています。これらの手法は比較モデリングとも呼ばれます。相同性モデリングの最初のステップは、一般的に、クエリ配列と相同性のある構造既知のテンプレート配列を特定することです。次に、クエリ配列をテンプレート配列にアラインメントします。アラインメント後、テンプレート構造を用いて構造的に保存された領域をモデリングします。続いて、テンプレートとは異なる側鎖とループをモデリングします。最後に、モデリングされた構造は改良され、品質評価が行われます。相同性モデリングデータに利用可能なサーバーは、SWISS MODEL、MODELLER、ReformAlign、PyMOD、TIP-STRUCTFAST、COMPASS、3d-PSSM、SAMT02、SAMT99、HHPRED、FAGUE、3D-JIGSAW、META-PP、ROSETTA、I-TASSERです。[ 5 ]

タンパク質の糸通し

タンパク質スレッディングは、クエリ配列の信頼できる相同構造が見つからない場合に使用できます。この方法は、まずクエリ配列とテンプレート構造のライブラリを取得します。次に、クエリ配列を既知のテンプレート構造にスレッディングします。これらの候補モデルは、スコアリング関数を用いてスコアリングされます。スコアリングは、クエリ配列とテンプレート配列の両方のポテンシャルエネルギーモデルに基づいて行われます。そして、最も低いポテンシャルエネルギーモデルとの一致が選択されます。スレッディングデータを取得し、計算を実行するための方法とサーバーは、以下に記載されています：GenTHREADER、pGenTHREADER、pDomTHREADER、ORFEUS、PROSPECT、BioShell-Threading、FFASO3、RaptorX、HHPred、LOOPPサーバー、Sparks-X、SEGMER、THREADER2、ESYPRED3D、LIBRA、TOPITS、RAPTOR、COTH、MUSTER。[ 5 ]

合理的設計の詳細については、部位特異的変異誘発を参照してください。

多価結合

多価結合は、アビディティ効果を通じて結合特異性と親和性を高めるために利用できます。単一の生体分子または複合体に複数の結合ドメインが存在すると、個々の結合イベントを介して他の相互作用が発生する可能性が高まります。アビディティまたは実効親和性は、個々の親和性の合計よりもはるかに高くなる可能性があり、標的結合のための費用対効果と時間効率の高いツールとなります。[ 6 ]

多価タンパク質

多価タンパク質は、翻訳後修飾やタンパク質コードDNA配列の増幅によって比較的容易に作製できます。多価タンパク質と多重特異性タンパク質の主な利点は、既知のタンパク質の標的に対する実効親和性を高めることができることです。不均一な標的の場合、多重特異性結合をもたらすタンパク質の組み合わせを用いることで特異性を高めることができ、これはタンパク質治療薬への応用性が高いと考えられます。

多価結合の最も一般的な例は抗体であり、二重特異性抗体に関する研究は広範に行われています。二重特異性抗体の用途は、診断、イメージング、予防、治療など、幅広い分野にわたります。[ 7 ] [ 8 ]

指向性進化

指向性進化では、エラープローンPCRや配列飽和突然変異などによるランダム突然変異をタンパク質に適用し、選択レジームを使用して目的の形質を持つ変異体を選択します。その後、突然変異と選択をさらに繰り返します。この方法は自然進化を模倣しており、一般に合理的設計よりも優れた結果を生み出します。DNAシャッフリングと呼ばれる追加のプロセスでは、成功した変異体の断片を混ぜ合わせて一致させ、より良い結果を生み出します。このようなプロセスは、有性生殖で自然に起こる組み換えを模倣しています。指向性進化の利点は、タンパク質の構造に関する事前の知識を必要とせず、特定の突然変異がどのような効果をもたらすかを予測する必要がないことです。実際、指向性進化実験の結果は、望ましい変化が、何らかの効果を持つとは予想されていなかった突然変異によって引き起こされることが多いという点で、驚くべきものであることがよくあります。欠点は、ハイスループットスクリーニングが必要になることですが、これはすべてのタンパク質で実行可能というわけではありません。大量の組み換えDNAを変異させ、産物を望ましい形質についてスクリーニングする必要があります。変異体の数が多いため、プロセスを自動化するには高価なロボット機器が必要になることがよくあります。さらに、必要な活動のすべてを検査することは容易ではありません。

自然のダーウィン進化論は、実験室で効果的に模倣することができ、触媒反応を含む多様な用途向けにタンパク質特性をカスタマイズすることができます。大規模で多様なタンパク質ライブラリを作成し、折り畳まれた機能的変異体をスクリーニングまたは選択するための実験技術は数多く存在します。折り畳まれたタンパク質はランダム配列空間で驚くほど頻繁に出現し、選択的結合剤や触媒の進化に利用できます。ランダム変異誘発と選択／スクリーニングによる既存タンパク質の再設計は、深い配列空間からの直接選択よりも保守的ですが、既存の特性を最適化または変更するための特に堅牢な方法です。また、より野心的な工学目標を達成するための優れた出発点となります。実験的進化と現代の計算手法を組み合わせることは、自然界に未知の機能性高分子を生成するための最も広範かつ実りある戦略であると考えられます。[ 9 ]

高品質な変異体ライブラリの設計という主要な課題は、近年大きな進歩を遂げてきました。この進歩は、変異負荷がタンパク質特性に及ぼす影響をより適切に記述できるようになったことによるものです。また、計算論的アプローチは、膨大な配列空間をより扱いやすいスクリーニング可能なサイズへと大きく進歩させ、変異体のスマートライブラリを構築しました。さらに、体系的組み換えアルゴリズムを用いて重要な有益な残基を特定することで、ライブラリサイズもスクリーニング可能なサイズまで縮小されました。さらに、タンパク質機能に対する変異の複合効果を定量化・予測する、より正確な統計モデルとアルゴリズムの開発により、酵素の効率的なリエンジニアリングに向けた大きな前進が遂げられました。[ 10 ]

一般的に、指向性進化は、タンパク質変異体ライブラリの作成と、改良された形質を持つ変異体を選択するためのハイスループットスクリーニングプロセスという、反復的な2段階プロセスとして要約できます。この技術は、タンパク質の構造と機能の関係に関する事前の知識を必要としません。指向性進化は、ランダムまたはフォーカスされた突然変異誘発を利用して変異タンパク質ライブラリを作成します。ランダム変異は、エラープローンPCRまたは部位飽和突然変異誘発のいずれかを用いて導入できます。変異体は、複数の相同遺伝子の組み換えによっても生成できます。自然界は限られた数の有益な配列を進化させてきました。指向性進化は、新しい機能を持つ未発見のタンパク質配列を特定することを可能にします。この能力は、タンパク質が折り畳み構造や安定性を損なうことなくアミノ酸残基の置換​​を許容する能力に依存します。[ 5 ]

指向性進化法は、無性法と有性法という 2 つの戦略に大別できます。

無性生殖の方法

無性生殖法では、親遺伝子間のクロスリンクは生成されません。単一の遺伝子を用いて、様々な変異誘発技術を用いて変異体ライブラリーを作成します。これらの無性生殖法は、ランダム変異または集中変異のいずれかを引き起こすことができます。

ランダム突然変異

ランダム変異誘発法は、対象遺伝子全体にランダムに変異を生じさせます。ランダム変異誘発では、遷移、転座、挿入、欠失、逆位、ミスセンス、ナンセンスといった種類の変異が誘発されます。ランダム変異誘発法の例を以下に示します。

エラーが発生しやすいPCR

エラープローンPCRは、Taq DNAポリメラーゼが3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないという事実を利用しています。この結果、複製あたりヌクレオチドあたり0.001～0.002%のエラー率となります。この方法は、変異させたい遺伝子、または遺伝子内の領域を選択することから始まります。次に、生成したい活性の種類と程度に基づいて、必要なエラーの範囲を計算します。このエラーの範囲によって、採用するエラープローンPCR戦略が決定されます。PCR後、遺伝子はプラスミドにクローニングされ、コンピテントセルシステムに導入されます。これらの細胞は、目的の形質についてスクリーニングされます。次に、改善された形質を示すコロニーをプラスミドから単離し、次の変異誘発ラウンドのテンプレートとして使用します。エラープローンPCRは、特定の変異に対して他の変異と比較して偏りを示します。例えば、転座よりもトランジションに偏りがあります。[ 5 ]

PCRにおけるエラー率は、以下の方法で増加する可能性がある。[ 5 ]

  1. 非相補的塩基対を安定化させる塩化マグネシウムの濃度を高めます。
  2. 塩基対の特異性を低下させるには塩化マンガンを加えます。
  3. dNTP の追加が増加し、不均衡になりました。
  4. dITP、8 オキソ dGTP、dPTP などの塩基類似体の付加。
  5. Taqポリメラーゼの濃度を高めます。
  6. 延長時間を延長します。
  7. サイクルタイムを増やします。
  8. 精度の低い Taq ポリメラーゼを使用します。

詳細については、 ポリメラーゼ連鎖反応も参照してください。

ローリングサークルエラープローンPCR

このPCR法は、細菌が環状DNAを増幅するために用いる方法をモデルにしたローリングサークル増幅法に基づいています。この方法では、直鎖DNA二本鎖が生成されます。これらの断片には、コンカタマーと呼ばれる環状DNAのタンデムリピートが含まれており、細菌株に形質転換することができます。まず、標的配列を適切なプラスミドにクローニングすることで、変異が導入されます。次に、エラープローンローリングサークル増幅条件下で、ランダムヘキサマープライマーとΦ29 DNAポリメラーゼを用いて増幅プロセスが開始されます。エラープローンローリングサークル増幅を生成するための追加条件は、テンプレートDNA 1.5 pM、MnCl 2 1.5 mM 、および24時間の反応時間です。MnCl 2は、DNA鎖におけるランダムな点変異を促進するために反応混合物に添加されます。変異率は、MnCl 2の濃度を増加させるか、テンプレートDNAの濃度を低下させることで増加させることができます。エラープローンローリングサークル増幅は、特異的プライマーではなくユニバーサルランダムヘキサマープライマーを使用するため、エラープローンPCRよりも有利です。また、この増幅反応の反応生成物はリガーゼやエンドヌクレアーゼで処理する必要がなく、反応は等温で進行する。[ 5 ]

化学的突然変異誘発

化学的変異誘発とは、化学物質を用いて遺伝子配列に変異を導入することです。化学的変異原の例を以下に示します。

亜硫酸水素ナトリウムは、G/Cに富むゲノム配列の変異に効果的です。これは、亜硫酸水素ナトリウムがメチル化されていないシトシンをウラシルに脱アミノ化する反応を触媒するためです。[ 5 ]

エチルメタンスルホン酸はグアニジン残基をアルキル化する。この変化はDNA複製中にエラーを引き起こす。[ 5 ]

亜硝酸はアデニンとシトシンの脱アミノ化によって転座を引き起こす。[ 5 ]

ランダム化学変異誘発への二重アプローチは、反復的な2段階プロセスです。まず、EMSを用いて対象遺伝子をin vivoで化学変異させます。次に、処理した遺伝子を単離し、プラスミド骨格の変異を防ぐために未処理の発現ベクターにクローニングします。[ 5 ]この技術により、プラスミドの遺伝的特性が保持されます。[ 5 ]

変異誘発のための埋め込みアレイへのグリコシラーゼの標的化（TaGTEAM）

この方法は、酵母における標的生体内変異誘発に用いられてきました 。この方法では、3-メチルアデニンDNAグリコシラーゼをtetR DNA結合ドメインに融合します。これにより、tetO部位を含むゲノム領域において、変異率が800倍以上増加することが示されています。[ 5 ]

ランダムな挿入と削除による突然変異誘発

この方法は、任意の長さの塩基の塊を同時に削除および挿入することにより、配列の長さを変化させます。この方法は、新たな制限酵素部位、特定のコドン、非天然アミノ酸用の4塩基コドンの導入により、新たな機能を有するタンパク質を産生することが示されている。[ 5 ]

トランスポゾンに基づくランダム突然変異誘発

最近、トランスポゾンを用いたランダム変異誘発法が数多く報告されています。これらの方法には、PERMUTEランダム円順列置換、ランダムタンパク質切断、ランダムヌクレオチドトリプレット置換、ランダムドメイン/タグ/複数アミノ酸挿入、コドンスキャン変異、マルチコドンスキャン変異などが含まれますが、これらに限定されるものではありません。これらの技術はすべて、ミニMuトランスポゾンの設計を必要とします。サーモサイエンティフィック社は、これらのトランスポゾンの設計キットを製造しています。[ 5 ]

標的DNAの長さを変えるランダム突然変異誘発法

これらの方法は、挿入変異と欠失変異によって遺伝子の長さを変化させるものです。一例として、タンデムリピート挿入法（TRINS法）が挙げられます。この技術では、ローリングサークル増幅によって標的遺伝子のランダムな断片のタンデムリピートが生成され、同時にこれらのリピートが標的遺伝子に組み込まれます。[ 5 ]

変異株

ミューテーター株は、1つ以上のDNA修復機構に欠陥のある細菌細胞株です。ミューテーター鎖の例として、大腸菌XL1-REDが挙げられます。[ 5 ]この大腸菌の従属株は、MutS、MutD、MutTといったDNA修復経路に欠陥があります。ミューテーター株の使用は多くの種類の変異を導入するのに有用ですが、これらの株は自身のゲノムに変異が蓄積するため、培養すると進行性の病変を示します。[ 5 ]

集中的突然変異誘発

焦点変異誘発法は、所定のアミノ酸残基に変異を生じさせます。これらの技術では、対象となるタンパク質の配列と機能の関係を理解することが求められます。この関係を理解することで、安定性、立体選択性、触媒効率に重要な残基を特定することが可能になります。[ 5 ]焦点変異誘発法の例を以下に示します。

部位飽和変異誘発

部位飽和変異は、タンパク質機能において重要な役割を果たすアミノ酸を標的とするPCR法です。この手法で最も一般的に用いられる2つの手法は、プラスミド全体を用いたシングルPCRとオーバーラップエクステンションPCRです。

全プラスミドシングルPCRは、部位特異的変異誘発（SDM）とも呼ばれます。SDM産物はDpnエンドヌクレアーゼ消化に供されます。この消化により、親鎖のみが切断されます。これは、親鎖にはアデニンのN6がメチル化されたGmATCが含まれているためです。SDMは10キロベースを超える大きなプラスミドには適していません。また、この方法では一度に2ヌクレオチドしか置換できません。[ 5 ]

オーバーラップ伸長PCRでは、2組のプライマーを用いる。各プライマーセットの1つには変異が含まれる。これらのプライマーセットを用いたPCRの第1ラウンドでは、2つの二本鎖DNA二重鎖が形成される。次に、第2ラウンドのPCRでこれらの二重鎖を変性させ、プライマーセットと再びアニールさせることで、各鎖に変異が含まれるヘテロ二重鎖を生成する。この新しく形成されたヘテロ二重鎖のギャップはDNAポリメラーゼによって補われ、さらに増幅される。[ 5 ]

配列飽和変異（SeSaM）

配列飽和変異は、標的配列のヌクレオチド位置ごとにランダム化をもたらす。この方法は、まず3'末端に鋳型転移酵素を用いて、ユニバーサル塩基を末端に有する可変長DNA断片を生成する。次に、これらの断片を一本鎖鋳型を用いて全長まで伸長させる。ユニバーサル塩基はランダムな標準塩基に置換され、変異を引き起こす。この方法には、SeSAM-Tv-II、SeSAM-Tv+、SeSAM-IIIなど、いくつかの改良版が存在する。[ 5 ]

単一プライマー反応の並列化（SPRINP）

この部位飽和変異法は、2つの別々のPCR反応を必要とする。最初の反応ではフォワードプライマーのみを使用し、2番目の反応ではリバースプライマーのみを使用する。これにより、プライマーダイマーの形成が回避される。[ 5 ]

メガプライムおよびリガーゼフリーの集中変異誘発

この部位飽和変異誘発法は、1つの変異誘発オリゴヌクレオチドと1つのユニバーサル・フランキングプライマーから始まります。これら2つの反応物は最初のPCRサイクルに用いられます。この最初のPCRサイクルで得られた産物は、次のPCRのメガプライマーとして用いられます。[ 5 ]

Ω-PCR

この部位飽和変異誘発法は、オーバーラップエクステンションPCRに基づいています。環状プラスミドの任意の部位に変異を導入するために使用されます。[ 5 ]

PFunkel-ominchange-OSCARR

この手法では、単一または複数の部位で同時にユーザー定義の部位特異的変異誘発を行います。OSCARRは、カセットランダム化および組み換えのためのワンポットシンプル法（One Pot Simple Methodology for Cassette Randomization and Recombination）の略称です。このランダム化と組み換えにより、タンパク質の目的の断片がランダム化されます。Omnichangeは、配列非依存型のマルチサイト飽和変異誘発であり、遺伝子上の最大5つの独立したコドンを飽和させることができます。

三量体-二量体変異誘発

この方法では、冗長なコドンと終止コドンを削除します。

カセット突然変異誘発

これはPCRをベースとした手法です。カセット突然変異誘発は、目的遺伝子を含むDNAカセットの合成から始まります。DNAカセットの両側には制限酵素部位が配置されています。これらの制限酵素部位を切断するエンドヌクレアーゼは、標的プラスミドの制限酵素部位も切断します。DNAカセットと標的プラスミドの両方をエンドヌクレアーゼで処理し、これらの制限酵素部位を切断して粘着末端を作成します。次に、この切断産物を連結することで、目的プラスミドに遺伝子が挿入されます。カセット突然変異誘発の別の形態であるコンビナトリアルカセット突然変異誘発は、目的タンパク質中の個々のアミノ酸残基の機能を特定するために用いられます。次に、再帰的アンサンブル突然変異誘発は、以前のコンビナトリアルカセット突然変異誘発から得られた情報を活用します。コドンカセット突然変異誘発では、二本鎖DNAの特定の部位に単一のコドンを挿入または置換することができます。[ 5 ]

性行為の方法

有性生殖による指向性進化の手法には、生体内での自然な組換えを模倣した試験管内組換えが含まれる。一般的に、これらの手法では親遺伝子間の高い配列相同性が必要となる。これらの手法は、2つの異なる親遺伝子の組換えによく用いられ、これらの遺伝子間に交差が生じる。[ 5 ]

試験管内相同組換え

相同組換えは、生体内（in vivo）と試験管内（in vitro）に分類できます。試験管内相同組換えは、生体内での自然な組換えを模倣したものです。これらの試験管内組換え法では、親遺伝子間の高い配列相同性が求められます。これらの技術は、親遺伝子を組み換えてキメラ遺伝子を生成することで、親遺伝子の自然な多様性を活用します。結果として得られるキメラは、親遺伝子の特徴が融合した状態を示します。[ 5 ]

DNAシャッフル

このin vitro技術は、組換え時代の初期の技術の一つでした。まず、相同な親遺伝子をDNase1で小さな断片に分解します。これらの小さな断片は、分解されていない親遺伝子から精製されます。精製された断片は、プライマーレスPCRを用いて再構成されます。このPCRでは、異なる親遺伝子由来の相同な断片が互いにプライミングし合い、キメラDNAが生成されます。親遺伝子と同じサイズのキメラDNAは、通常のPCRで末端プライマーを用いて増幅されます。[ 5 ]

ランダムプライミングin vitro組換え（RPR）

このin vitro相同組換え法は、ランダム配列プライマーを用いて、点変異を示す多数の短い遺伝子断片を合成することから始まります。これらの断片は、プライマーレスPCRを用いて全長の親遺伝子に再構成されます。再構成された配列はPCRで増幅され、さらなる選抜プロセスにかけられます。この方法は、DNase1を使用しないため、ピリミジンヌクレオチドの隣で組換えが起こるという偏りがなく、DNAシャッフリングに比べて有利です。また、長さが均一で偏りのない合成ランダムプライマーを使用するという利点もあります。最後に、この方法はDNAテンプレート配列の長さに依存せず、少量の親DNAしか必要としません。[ 5 ]

切断型メタゲノム遺伝子特異的PCR

この方法は、メタゲノムサンプルから直接キメラ遺伝子を生成する。まず、メタゲノムDNAサンプルから機能スクリーニングを行い、目的の遺伝子を単離する。次に、特異的プライマーを設計し、異なる環境サンプルから相同遺伝子を増幅する。最後に、増幅された相同遺伝子をシャッフルすることで、目的の機能クローンを回収するためのキメラライブラリを作成する。[ 5 ]

段階的延長プロセス（StEP）

このin vitro法は、テンプレートスイッチングを利用してキメラ遺伝子を生成する。PCRをベースとしたこの方法は、まずテンプレートの初期変性を行い、続いてプライマーのアニーリングと短い伸長時間を行う。その後のサイクルでは、前のサイクルで生成された短い断片とテンプレートの異なる部分との間でアニーリングが生じる。これらの短い断片とテンプレートは、配列の相補性に基づいてアニーリングする。この断片がテンプレートDNAにアニーリングするプロセスは、テンプレートスイッチングと呼ばれる。アニーリングされた断片は、その後の伸長反応のためのプライマーとして働く。この方法は、親長のキメラ遺伝子配列が得られるまで実行される。この方法を実行するには、まず隣接するプライマーのみが必要である。Dnase1酵素も必要ない。[ 5 ]

一時的テンプレート上のランダムキメラジェネシス（RACHITT）

この方法は、キメラ遺伝子あたり平均14回の交差を伴うキメラ遺伝子ライブラリーを生成することが示されている。この方法は、まず、親遺伝子の上鎖断片を、相同遺伝子由来のウラシル含有鋳型の下鎖に整列させることから始まる。5'および3'オーバーハングフラップは切断され、Pfuおよびtaq DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性によってギャップが埋められる。次に、ウラシル含有鋳型はウラシルDNAグリコシラーゼ処理によってヘテロ二本鎖から除去され、PCRを用いてさらに増幅される。この方法は、比較的高い交差頻度でキメラを生成できるという利点がある。しかし、複雑さと、一本鎖DNAおよびウラシル含有一本鎖鋳型DNAを生成する必要があることから、ある程度の限界がある。[ 5 ]

合成シャッフル

合成縮重オリゴヌクレオチドのシャッフルは、最適なコドンと有益な変異を含むオリゴヌクレオチドを含めることができるため、シャッフル法に柔軟性を追加します。[ 5 ]

生体内相同組換え

酵母を用いたクローニングでは、断片化された発現ベクターをPCRに依存して再構成する。再構成されたベクターは酵母に導入され、クローニングされる。酵母を用いてベクターをクローニングすることで、大腸菌でのライゲーションと増殖によって生じる毒性や逆選択を回避できる。[ 5 ]

相同生体内グループ化による突然変異誘発性の組織的組換えプロセス（MORPHING）

この方法は、酵母における相同組換えの高頻度を利用して、遺伝子の特定の領域に変異を導入し、他の部分はそのまま残す。[ 5 ]

ファージ支援連続進化（PACE）

この方法は、進化する遺伝子を宿主から宿主へと伝達するために、ライフサイクルを改変したバクテリオファージを利用する。ファージのライフサイクルは、伝達が酵素の目的の活性と相関するように設計されている。この方法は、遺伝子の継続的な進化に必要な人的介入を最小限に抑えられるという利点がある。[ 5 ]

試験管内非相同組換え法

これらの方法は、タンパク質は配列相同性がなくても同様の構造的同一性を示す可能性があるという事実に基づいています。

エクソンシャッフル

エクソンシャッフリングとは、イントロンにおける組換え反応によって、異なるタンパク質由来のエクソンを結合させることである。オーソログエクソンシャッフリングとは、異なる種のオーソログ遺伝子由来のエクソンを結合させることである。オーソログドメインシャッフリングとは、異なる種のオーソログ遺伝子由来のタンパク質ドメイン全体をシャッフリングすることである。パラログエクソンシャッフリングとは、同じ種の異なる遺伝子由来のエクソンをシャッフリングすることである。パラログドメインシャッフリングとは、同じ種のパラログタンパク質由来のタンパク質ドメイン全体をシャッフリングすることである。機能的ホモログシャッフリングとは、機能的に関連する非相同ドメインをシャッフリングすることである。これらのプロセスはすべて、キメラ合成オリゴヌクレオチドを用いて、異なる遺伝子由来の目的のエクソンを増幅することから始まる。この増幅産物は、プライマーレスPCRを用いて完全長遺伝子に再構成される。これらのPCRサイクル中、断片は鋳型およびプライマーとして機能する。こうして得られたキメラ完全長遺伝子は、スクリーニングに供される。[ 5 ]

ハイブリッド酵素の作成のための増分切断（ITCHY）

親遺伝子の断片は、エキソヌクレアーゼ III による制御された消化を使用して作成されます。これらの断片は、エンドヌクレアーゼを使用して平滑化し、連結してハイブリッド遺伝子を生成します。 THIOITCHY は、α-ホスホチオエート dNTPなどのヌクレオチド三リン酸類似体を利用する修正 ITCHY 技術です。これらのヌクレオチドの取り込みにより、エキソヌクレアーゼ III による消化がブロックされます。このエキソヌクレアーゼ III による消化の阻害は、スパイキングと呼ばれます。スパイキングは、最初にエキソヌクレアーゼで遺伝子を切り詰めて、短い一本鎖オーバーハングを持つ断片を作成することによって実現できます。次に、これらの断片は、少量のホスホチオエート dNTP の存在下で、DNA ポリメラーゼによる増幅のテンプレートとして機能します。次に、これらの結果として得られた断片を連結して完全長の遺伝子を形成します。あるいは、通常の dNTP とホスホチオエート dNTP の存在下で、無傷の親遺伝子を PCR で増幅することもできます。これらの完全長増幅産物は、エキソヌクレアーゼによる消化にかけられます。エキソヌクレアーゼがα-pdNTPに遭遇するまで消化は継続され、異なる長さの断片が生成されます。これらの断片は連結され、キメラ遺伝子が生成されます。[ 5 ]

スクラッチ

この方法は、DNAシャッフルとITCHYを組み合わせることで、多重交差を阻害するハイブリッド遺伝子のライブラリーを作成する。この方法は、2つの独立したITCHYライブラリーの構築から始まる。1つはN末端に遺伝子Aを持つ。もう1つはN末端に遺伝子Bを持つ。これらのハイブリッド遺伝子断片は、制限酵素消化または末端プライマーを用いたPCR（アガロースゲル電気泳動法）によって分離される。分離された断片は混合され、DNase1を用いてさらに消化される。消化された断片は、テンプレートスイッチングを用いたプライマーレスPCRによって再構成される。[ 5 ]

短縮テンプレートの再結合拡張（RETT）

この方法は、キメラ遺伝子の鋳型となる一本鎖DNA断片の存在下で、一方向に伸長するポリヌクレオチドの鋳型スイッチによってハイブリッド遺伝子のライブラリーを生成する。この方法は、標的mRNAからの逆転写によって一本鎖DNA断片を調製することから始まる。次に、遺伝子特異的プライマーを一本鎖DNAにアニールさせる。これらの遺伝子はPCRサイクル中に伸長される。このサイクルの後、鋳型スイッチと、先のプライマー伸長で得られた短い断片を他の一本鎖DNA断片にアニールさせる。このプロセスは、全長の一本鎖DNAが得られるまで繰り返される。[ 5 ]

配列相同性非依存性タンパク質組換え（SHIPREC）

この方法は、配列相同性がほとんどないか全くない遺伝子間の組み換えを引き起こす。これらのキメラ遺伝子は、複数の制限酵素部位を含むリンカー配列を介して融合される。このコンストラクトはDNase1を用いて消化される。作製された断片はS1ヌクレアーゼを用いて平滑末端化される。これらの平滑末端断片はライゲーションによって環状配列にまとめられる。この環状コンストラクトは、リンカー領域に制限酵素部位が存在する制限酵素を用いて線状化される。これにより、開始コンストラクトと比較して、5'末端と3'末端への遺伝子の寄与が逆転したキメラ遺伝子ライブラリが得られる。[ 5 ]

配列非依存性部位特異的キメラジェネシス（SISDC）

この方法により、複数の親遺伝子から多重交差した遺伝子ライブラリーが得られる。この方法では、親遺伝子間の配列同一性は必要とされない。ただし、交差部位ごとに1つまたは2つの保存されたアミノ酸が必要となる。この方法は、親遺伝子の配列をアラインメントし、交差部位となるコンセンサス領域を特定することから始まります。次に、制限酵素部位を含む特定のタグを組み込み、Bac1消化によってタグを除去することで、付着末端を持つ遺伝子が得られる。これらの遺伝子断片を適切な順序で混合し、連結することでキメラライブラリーが形成される。[ 5 ]

縮重ホモ二本鎖組換え（DHR）

この方法は、相同遺伝子のアライメントから始まり、続いて多型領域を同定する。次に、遺伝子の上鎖を小さな縮重オリゴヌクレオチドに分割する。下鎖もオリゴヌクレオチドに分解され、足場として機能する。これらの断片は溶液中で混合され、上鎖オリゴヌクレオチドが下鎖オリゴヌクレオチド上に組み立てられる。これらの断片間のギャップはポリメラーゼによって埋められ、ライゲーションされる。[ 5 ]

ランダムマルチリコンビナントPCR（RM-PCR）

この方法では、相同性のない複数のDNA断片を1回のPCRでシャッフルします。これにより、異なる構造単位をコードするモジュールを組み立てることで、完全なタンパク質が再構築されます。[ 5 ]

ユーザーフレンドリーなDNA組み換え（USERec）

この方法は、ウラシルdNTPを用いて、組換えが必要な遺伝子断片を増幅することから始まります。この増幅溶液には、プライマー、PfuTurbo、Cx Hotstart DNAポリメラーゼも含まれています。増幅産物は次にUSER酵素と反応させます。この酵素はDNAからウラシル残基を除去し、1塩基対のギャップを作ります。USER酵素処理された断片は混合され、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションされ、Dpn1消化によって鋳型DNAが除去されます。得られた2本鎖断片はPCR増幅され、大腸菌に形質転換されます。[ 5 ]

ゴールデンゲートシャッフル（GGS）組換え

この方法では、制限酵素部位の外側を切断するタイプ2制限酵素を用いることで、アクセプターベクター内で少なくとも9つの異なる断片を組み換えることができます。まず、別々のベクターに断片をサブクローニングし、両側にBsa1隣接配列を作成します。次に、これらのベクターをタイプ2制限酵素Bsa1で切断し、4ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを生成します。相補的なオーバーハングを持つ断片はハイブリダイズされ、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションされます。最後に、これらのコンストラクトを大腸菌に形質転換し、発現レベルをスクリーニングします。[ 5 ]

ホスホロチオエートベースのDNA組換え法（PRTec）

この方法は、構造要素またはタンパク質ドメイン全体の組換えに使用できます。この方法は、ホスホロチオジエステル結合の特異的切断を可能にするホスホロチオエート化学に基づいています。プロセスの第一歩は、ベクター骨格とともに組換えが必要な断片の増幅から始まります。この増幅は、5'末端にホスホロチオレート化されたヌクレオチドを持つプライマーを用いて行われます。増幅されたPCR産物は、高温のエタノール-ヨウ素溶液中で切断されます。次に、これらの断片は室温でハイブリダイズされ、大腸菌に形質転換され、切断部分を修復します。[ 5 ]

インテグロン

このシステムは、大腸菌における天然の部位特異的組換えシステムに基づいています。このシステムはインテグロンシステムと呼ばれ、自然な遺伝子シャッフリングを引き起こします。この方法は、インテグロンシステムを用いて、個々の組換えカセットまたはtrpA-E遺伝子と調節エレメントを送達することにより、trp欠損大腸菌において機能的なトリプトファン生合成オペロンを構築し、最適化するために使用されました。[ 5 ]

Yライゲーションベースのシャッフル（YLBS）

この方法は、5' 末端または 3' 末端のいずれかに単一のブロック配列、ステムループ領域の相補配列、および PCR のプライマー結合部位として機能する D 分岐領域を含む 1 本鎖 DNA 鎖を生成します。5' および 3' ハーフストランドの両方を等量混合し、ステム領域の相補性によりハイブリッドを形成します。次に、3' ハーフストランドの遊離リン酸化 5' 末端を持つハイブリッドを、0.1 mM ATP 存在下で T4 DNA リガーゼを使用して 5' ハーフストランドの遊離 3' 末端とライゲーションします。次に、ライゲーションされた産物を 2 種類の PCR で増幅して、プレ 5' ハーフとプレ 3' ハーフの PCR 産物を生成します。これらの PCR 産物は、ビオチン標識されたステム配列を含むプライムの 5' 末端にアビジン-ビオチンが結合することで、1 本鎖に変換されます。次に、ビオチン化された5'ハーフストランドと非ビオチン化された3'ハーフストランドが、次のYライゲーションサイクルの5'ハーフストランドと3'ハーフストランドとして使用されます。[ 5 ]

半合理的設計

半合理的設計では、タンパク質の配列、構造、機能に関する情報を予測アルゴリズムと組み合わせて使用​​します。これらを組み合わせることで、タンパク質の機能に最も影響を与える可能性の高い標的アミノ酸残基を特定します。これらの重要なアミノ酸残基の変異により、特性が向上する可能性の高い変異タンパク質のライブラリが作成されます。[ 11 ]

半合理的酵素工学とde novo酵素設計の進歩は、研究者に生体触媒を操作するための強力かつ効果的な新しい戦略を提供しています。ライブラリー設計における配列と構造に基づくアプローチの統合は、酵素の再設計にとって優れた指針となることが証明されています。一般的に、現在の計算によるde novoおよび再設計手法は、進化した変異体と触媒性能において比較になりません。指向性進化を用いて実験的な最適化を実現できる可能性はありますが、構造予測の精度と触媒能力のさらなる向上は、設計アルゴリズムの改良によって達成されるでしょう。将来のシミュレーションでは、タンパク質ダイナミクスを統合することで、さらなる機能強化が実現される可能性があります。[ 11 ]

生化学的および生物物理学的研究、そして予測フレームワークの微調整は、個々の設計特徴の機能的意義を実験的に評価する上で有用である。これらの機能的貢献をより深く理解することで、将来の設計改善のためのフィードバックが得られるだろう。[ 11 ]

計算によるタンパク質設計は、タンパク質工学における生体高分子の操作方法を根本的に変えましたが、指向性進化がタンパク質工学の選択肢として取って代わられることはまずないでしょう。仮説駆動型タンパク質工学のための予測フレームワークを組み込んだ手法を用いることで、より小規模で、より焦点を絞った、機能豊富なライブラリを生成できる可能性があります。新たな設計戦略と技術の進歩は、従来のプロトコルからの脱却を始めています。例えば、指向性進化は、焦点を絞ったライブラリから最も優れた候補物質を同定するための最も効果的な戦略です。全遺伝子ライブラリ合成は、ライブラリ調製におけるシャッフル法や変異誘発法に取って代わりつつあります。また、数百万もの候補物質をスクリーニング・選抜する膨大な作業の代わりに、非常に特異的な低スループットスクリーニングアッセイがますます利用されるようになっています。これらの進歩は、タンパク質工学を指向性進化の域を超え、生体触媒をカスタマイズするための実用的で効率的な戦略へと進化させる可能性を秘めています。[ 11 ]

スクリーニングと選択技術

タンパク質が指向性進化、配給設計、または半配給設計を経てから、変異タンパク質のライブラリーをスクリーニングし、どの変異体が特性の向上を示すかを特定する必要があります。ファージディスプレイ法は、タンパク質スクリーニングの一つの選択肢です。この方法では、変異ポリペプチドをコードする遺伝子とファージコートタンパク質遺伝子を融合させます。ファージ表面に発現したタンパク質変異体は、in vitroで固定化された標的と結合することにより選択されます。選択されたタンパク質変異体を持つファージは、細菌内で増幅され、酵素結合免疫吸着法によって陽性クローンが同定されます。選択されたファージは、DNAシークエンシングにかけられます。[ 5 ]

細胞表面ディスプレイシステムは、変異ポリペプチドライブラリのスクリーニングにも利用できます。ライブラリ中の変異遺伝子は発現ベクターに組み込まれ、適切な宿主細胞に形質転換されます。これらの宿主細胞は、さらにハイスループットスクリーニング法にかけられ、目的の表現型を持つ細胞が同定されます。[ 5 ]

無細胞ディスプレイシステムは、 in vitroタンパク質翻訳または無細胞翻訳を利用するために開発されてきた。これらの方法には、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、共有結合型および非共有結合型DNAディスプレイ、 in vitroコンパートメント化などが含まれる。[ 5 ]：53

酵素工学

酵素工学とは、酵素の構造（ひいては機能）を改変したり、単離酵素の触媒活性を改変したりすることで、新たな代謝産物を生成したり、新たな（触媒された）反応経路を可能にしたり、[ 12 ]あるいは特定の化合物を他の化合物に変換したり（生体内変換）する応用である。これらの生成物は、化学薬品、医薬品、燃料、食品、または農業添加物として有用である。

酵素リアクター[ 13 ]は、酵素を用いて所望の変換を行うための反応媒体が入った容器で構成されています。このプロセスで使用される酵素は溶液中に遊離しています。

人工タンパク質の例

コンピューティング手法は、 Top7 [ 14 ]などの新しい折り畳み構造を持つタンパク質や、非天然分子用のセンサー[ 15 ]を設計するために使用されてきた。融合タンパク質のエンジニアリングにより、クリオピリン関連周期性症候群の治療薬として米国食品医薬品局（FDA）の承認を取得した医薬品、リロナセプトが開発された。

別の計算手法であるIPROは、カンジダ・ボイディニキシロース還元酵素の補因子特異​​性の切り替えを設計することに成功した。 [ 16 ]反復タンパク質再設計・最適化（IPRO）は、タンパク質を再設計して、天然または新規の基質および補因子 への特異性を高めたり、付与したりする。これは、指定された設計位置の周囲にあるタンパク質の構造を繰り返しランダムに摂動させ、回転異性体の最も低いエネルギーの組み合わせを特定し、新しい設計が以前のものよりも結合エネルギーが低いかどうかを判断することによって行われる。このプロセスの反復的な性質により、IPROはタンパク質配列に付加的な変異を加えることで、望ましい基質および/または補因子への特異性を総合的に向上させることができる。[ 16 ]

計算支援設計は、高度に秩序化されたナノタンパク質アセンブリの複雑な特性を設計するためにも使用されている。[ 17 ] 2つのオリゴマー化状態を占めることによって構造不安定性と不完全な自己組織化挙動を自然に示しているタンパク質ケージである大腸菌バクテリオフェリチン（EcBfr）が、この研究のモデルタンパク質である。計算分析と相同体との比較により、このタンパク質は、主に2つの水架橋アスパラギン残基を中心とした界面水ポケットの存在により、2回対称軸上の二量体界面が平均よりも小さいことがわかった。EcBfrを変更した構造安定性の設計の可能性を調査するため、半経験的計算方法を使用して、野生型EcBfrと比較した480の可能な変異体の二量体界面でのエネルギー差を仮想的に調査した。この計算研究は、水架橋アスパラギンにも収束している。これらの2つのアスパラギンを疎水性アミノ酸に置換すると、円二色性および透過型電子顕微鏡で示されるように、 αヘリックスモノマーに折り畳まれ、ケージ状に集合するタンパク質が得られます。熱変性および化学変性の両方において、再設計されたすべてのタンパク質は計算と一致し、安定性が向上していることが確認されました。3つの変異のうち1つは、サイズ排除クロマトグラフィーとネイティブゲル電気泳動の両方で示されるように、溶液中で高次オリゴマー化状態を形成するようにタンパク質集団を変化させます。[ 17 ]

細菌チャネルタンパク質（OmpF）を1nmの細孔サイズから任意のサブnmサイズまで再設計するために、 in silico手法であるPoreDesigner [ 18 ]が開発されました。設計された最も狭い細孔を用いた輸送実験では、生体模倣ブロックポリマーマトリックスに組み込んだ際に完全な塩除去が達成されることが明らかになりました。

参照

参考文献

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