ノックアウトラット

ノックアウトラットとは、標的遺伝子の突然変異（遺伝子トラッピング）によって特定の遺伝子を欠損させた遺伝子改変ラットのことで、学術研究や医薬研究に用いられます。ノックアウトラットはヒトの疾患を模倣することができ、遺伝子機能の研究（機能ゲノミクス）や創薬開発のための重要なツールです。ノックアウトラットの作製は、2008年まで経済的にも技術的にも実現可能ではありませんでした。[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]

国立衛生研究所（NIH）からの資金援助と、ノックアウトラットコンソーシアム（KORC）は、費用対効果の高いノックアウトラット作製法の開発を主導しました。ラットをヒトの健康研究のためのより汎用性の高いツールとして開発することの重要性は、NIHがノックアウトラット研究プログラム（KORC）を通じて行った1億2000万ドルの投資からも明らかです。ラットゲノム配列決定プロジェクトコンソーシアムによって、ドブネズミ（ Rattus norvegicus ）の実験室株のドラフト配列が得られた。 [ 5 ] 2009年には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術のさらなる開発により、標的の生殖細胞伝達変異を持つ最初のノックアウトラットが誕生した。 [ 6 ]ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を用いたパーキンソン病、アルツハイマー病、高血圧、糖尿病 のノックアウトラット疾患モデルは、SAGE Labsによって商品化されている。 [ 7 ] [ 8 ]

研究用途

マウス、ラット、そしてヒトは、約1%を除くすべての遺伝子を共有しており[ 5 ] [ 9 ] [ 10 ]、げっ歯類はヒトの遺伝子機能を研究するための優れたモデル生物です。マウスとラットはどちらも比較的小型で、扱いやすく、世代時間が短く、遺伝的に近交系です。マウスは有用なげっ歯類モデルであることが証明されており、その遺伝子を日常的に破壊するための技術も開発されていますが、多くの場合、ラットはヒトの疾患の研究とモデル化のための優れた実験動物と考えられています。

ラットはマウスよりも生理的にヒトに近い。例えば、ラットの心拍数はヒトに近いが、マウスの心拍数はヒトの5～10倍速い。ヒトの心血管疾患、糖尿病、関節炎、および多くの自己免疫疾患、神経疾患、行動疾患、依存症のモデルとしては、マウスよりもラットの方が適していると広く考えられている。[ 11 ]さらに、ラットモデルは、潜在的な治療化合物の薬力学と毒性の試験にはマウスモデルよりも優れている。これは、ラットの解毒酵素の数と種類の多くがヒトのものと非常に似ていることが一因である。[ 12 ]ラットは体が大きいため、機器を用いた研究に適しており、採血、神経伝導、手術などの操作も容易である。

マウスでは遺伝子操作技術が利用可能であり、ヒト疾患モデルとして広く用いられています。マウス遺伝子の約60% [ 13 ]についてはノックアウトが報告されていますが、一般的なヒト疾患の大部分にはノックアウトマウスモデルが存在しません。ノックアウトラットモデルはマウスの代替モデルであり、マウスでは不可能な新たな遺伝子破壊を可能にする可能性があります。また、ノックアウトラットモデルは既存のトランスジェニックマウスモデルを補完することもできます。マウスとラットの変異体を比較することで、げっ歯類特有の表現型と一般的な哺乳類の表現型を区別することが容易になります。

生産上の課題

ラットモデルは、心血管疾患、精神疾患（行動介入および依存症の研究）、神経再生、糖尿病、移植、自己免疫疾患（関節リウマチ）、癌、および創傷および骨の治癒を含む多くの医学研究分野を進展させるために使用されてきた。ラットのゲノム配列が完成することで非常に重要な情報が得られるが、これらの疾患が遺伝子機能とどのように関連しているかを知るには、特定のゲノム配列を操作するノックアウトラットモデルを効率的に作成する方法が必要である。遺伝子操作のほとんどの技術、例えば遺伝子トラップによるランダム突然変異誘発（レトロウイルスベースおよび非レトロウイルスベース）、遺伝子ノックアウト/ノックイン、および条件付き突然変異などは、胚性幹（ES）細胞の培養と操作に依存している。[ 14 ]ラットES細胞はつい最近単離されたばかりで、その遺伝子改変の実証は報告されていない。そのため、マウスで広く使用されている多くの遺伝子操作技術は、ラットでは不可能である。

初期の方法

2007年のモバイルDNA技術と2009年のジンクフィンガーヌクレアーゼ技術の商業開発までは、ヒト疾患のラットモデルを作製するために使用できる技術は、クローニングとN-エチル-N-ニトロソウレア（ENU ）を使用した化学的変異誘発の2つしかありませんでした。体細胞核移植（SCNT）によるクローニングは、理論的には体細胞を変異させ、これらの細胞をSCNTに使用することで特定の変異を持つラットを作成するために使用できますが、この方法はノックアウトラットの作成にうまく使用されていません。この戦略の1つの問題は、SCNTが極めて非効率的であることです。最初に発表された試みの成功率は1％未満でした。[ 15 ]また、ENU突然変異誘発は、マウスで一般的なランダム突然変異誘発遺伝子ノックアウト戦略であり、ラットでも使用できます。ENU突然変異誘発では、化学物質N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）を使用してゲノムに1塩基の変化を作成します。 ENUは、そのエチル基をDNA中の酸素または窒素ラジカルに転移させ、誤対合および塩基対置換を引き起こす。ENUを雄マウスに注入し、野生型の雌と交配させて突然変異の子孫を産出することで、突然変異動物を作出することができる。ENUの突然変異誘発は、200～700配偶子ごとに任意の遺伝子で約1塩基対の変化を伴う、高頻度のランダム突然変異を引き起こす。[ 16 ]高い突然変異誘発性にもかかわらず、ENUの物理的な浸透は限られており、雄1匹あたり約500遺伝子のみが突然変異し、観察可能な表現型を持つ突然変異は全体のごくわずかである。通常、1つの新しい表現型を生成するためには、1匹の動物で数千の突然変異を作成する必要がある。

ENU技術は最近改良されたが、[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]、特定の表現型の原因となる突然変異のマッピングは通常困難で時間がかかります。中立突然変異は、広範囲な繁殖によって原因となる突然変異から分離する必要があります。ENUおよびクローニング法は、ラットで遺伝子ノックアウトを作成してマッピングし、新しいヒト疾患モデルを作成するには、単純に非効率的です。2007年までに、ウィスコンシン医科大学が実行したこれまでで最大のラットENU突然変異誘発プロジェクトでは、5年間でノックアウトラインあたり平均20万ドルのコストでわずか9系統のノックアウトラット系統を生成することができました。一部の企業はまだこの戦略を追求していますが、ウィスコンシン医科大学は、モバイルDNAとCompoZr ZFN技術を使用する、より効率的で商業的に実現可能な方法に切り替えました。

ジンクフィンガーとTALEヌクレアーゼ技術

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）と転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、ユーザーが指定した場所でDNAに二本鎖切断を作り出すことでゲノムの標的編集を容易にする改変DNA結合タンパク質です。二本鎖切断は、細胞の自然なDNA修復プロセス、すなわち相同組み換えと非相同末端結合を刺激するため、部位特異的変異誘発に重要です。細胞が非相同末端結合経路を使用して二本鎖切断を修復する場合、修復に固有の不正確さにより、正確に標的を絞った変異が頻繁に生成されます。その結果、標的遺伝子がノックアウトされた胚が生じます。[ 6 ] [ 20 ]標準的なマイクロインジェクション技術により、この技術で4～6か月でノックアウトラットを作製できます。モバイルDNAを用いた場合と比較した、ZFNおよびTALENを介した遺伝子ノックアウトの大きな利点は、特定の遺伝子を特異的かつ特異的にノックアウトの標的とすることができることです。一方、モバイルDNA技術を用いたノックアウトはランダムであるため、目的の遺伝子を標的とする可能性は低くなります。

モバイルDNA技術

モバイルDNA（ジャンピング遺伝子）技術は、レトロトランスポゾンとトランスポゾンを用いてノックアウトラットモデルを作製する。このプラットフォーム技術は、ラットを含む哺乳類モデル生物の生殖細胞（精子と卵母細胞）に直接ランダム変異を誘発させることにより、哺乳類における遺伝子ノックアウト手法を成功させるための基準をすべて満たしている。この技術を用いることで、遺伝子は完全にかつ安定的に破壊され、高頻度でノックアウトされ、ゲノム全体にわたってランダムに破壊される。変異のゲノム上の位置は容易にマッピングできるため、後で使用するためのノックアウトラットのライブラリーを作成することができる。ランダムノックアウト変異が作成されると、ノックアウト系統と組織特異的にCREリコンビナーゼを発現するラット系統を交配することにより、条件付き変異などのより洗練された変異を作成することができる。ノックインは、組換えを介したカセット交換によって生成することができる。

piggyBac (PB) DNAトランスポゾン

piggyBacトランスポゾン技術

piggyBac（PB）DNAトランスポゾンは、「カットアンドペースト」機構を介して移動します。この機構では、トランスポゾン自体によってコードされているトランスポザーゼ酵素（PBトランスポザーゼ）が、トランスポゾンをゲノム内の他の部位に切除し、再組み込みします。PBトランスポザーゼは、トランスポゾンの両側にあるPB逆位末端反復配列（ITR）を特異的に認識し、これらの配列に結合してトランスポゾンの切除を触媒します。その後、PBはゲノム全体のTTAA部位[ 21 ]に、比較的ランダムな様式で組み込みます。遺伝子トラップ変異を作成する場合（またはトランスジェニック動物を生成するために適応させる場合）、トランスポザーゼは1つのプラスミド上でトランスに供給され、ドナートランスポゾンを含むプラスミドと共導入されます。ドナートランスポゾンは、トランスポザーゼの結合部位（ITR）に両側に挟まれた遺伝子トラップを含む組換えトランスポゾンです。トランスポザーゼは、プラスミドからトランスポゾンを切り出し、ゲノムに組み込む触媒作用をします。コード領域への組み込みは、遺伝子トラップ発現に必要な要素を捕捉します。PBはいくつかの理想的な特性を備えています。(1) 遺伝子内に優先的に挿入されます（挿入の50～67%が遺伝子にヒットします）。(2) 局所ホッピングを示さない（ゲノムを広範囲にカバーします）。(3) トランスポザーゼの過剰産生阻害（トランスポゾンのレベルの上昇によって転座が減少する）の影響を受けません。(4) Sleeping Beautyとは異なり、ドナー部位からきれいに切り出され、「フットプリント」を残さない。 [ 22 ] [ 23 ]

眠れる森の美女（SB）トランスポゾン

眠れる森の美女トランスポゾン技術

スリーピングビューティー（SB）トランスポゾンは、脊椎動物と無脊椎動物の両方のゲノムに広く分布するTc1/marinerスーパーファミリーのDNAトランスポゾンの派生種です。しかし、このファミリーの内因性DNAトランスポゾンは、脊椎動物ゲノムでは完全に不活性です。サケ科の要素サブファミリーの不活性トランスポゾンを配列させて合成された活性Tc1/marinerトランスポゾンが「覚醒」し、スリーピングビューティーと名付けられたトランスポゾンを形成しました。[ 24 ] SBは、他のDNAトランスポゾンと同様に、カットアンドペースト機構によって自己活性化します。この機構では、トランスポゾン自体によってコードされているトランスポザーゼ酵素が、ゲノム内の他の部位でトランスポゾンを切除し、再組み込みます。340アミノ酸からなるSBタンパク質は、トランスポゾンの両側にある逆位末端反復配列（ITR）を認識し、これらの配列に結合してトランスポゾンの切除を触媒します。 SBはその後ゲノム内のランダムな部位に組み込まれるが、いくつかの研究では転写単位に対するわずかな好みが報告されている。[ 25 ] [ 26 ]また、すべてのTc1/marinerトランスポゾンと同様に、標的部位にTAジヌクレオチドが1つだけ必要である。[ 27 ]

SBトランスポゾンは、多くの脊椎動物種において挿入変異誘発のための強力なツールです。最近、マウスとラットの両方において、生殖細胞系列の変異誘発において特に有用であることが示されました。[ 28 ] [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] SBが遺伝子発見に向けた非常に魅力的な変異原となる理由はいくつかあります。1) 特定のゲノム領域または特定の認識配列への挿入に対する偏りがほとんどないこと、2) トランスポゾンのde novo挿入は「タグ付き」配列マーカーを提供し、簡単なPCRクローニング法によって特定の変異を迅速に同定できること、3) 生体内でのSB挿入変異誘発により、単一の動物、そして腺腫性ポリープなどの単一の組織において、複数の変異を迅速かつ容易に生成できることなどです。

LINE1（L1）レトロトランスポゾン

L1レトロトランスポゾン技術

トランスポゾンとレトロトランスポゾンは、遺伝子破壊に用いられる可動性DNA断片として、偏りのない遺伝子発見のための貴重なツールです。LINE（長鎖散在核配列）などのレトロトランスポゾンは、「コピー＆ペースト」機構によって移動し、多くの真核生物種に豊富に存在します。マウスとヒトでは、いくつかのL1レトロトランスポゾンが活性を維持しています。L1は、発現を誘導する5'非翻訳領域内の小さな内部プロモーター、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）、およびポリアデニル化のための配列を含む3'非翻訳領域を含みます。2つのORFは、自律的なレトロトランスポジションに必要なタンパク質をコードします。ORF1はRNA結合タンパク質をコードし、ORF2はエンドヌクレアーゼ（EN）および逆転写酵素（RT）活性を含むタンパク質をコードします。これらのタンパク質は、DNAに切断部位を形成し、逆転写酵素（RT）を介してコピーを生成します。これらのタンパク質は、自身をコードする転写産物に結合して作用する圧倒的な特異性を示し、親L1 RNAをほぼ排他的に移動させることを可能にします。 ORF2タンパク質の逆転写活性を利用して、転写されたL1 RNAは標的プライミング逆転写（TPRT）と呼ばれるプロセスによってDNAにコピーされ、[ 35 ]ゲノムに組み込まれます。組み込みは特定のゲノム領域に対してほとんど偏りなく行われ、単純なコンセンサス配列5′TTTT′A-3′（およびこの配列のわずかな変異）を必要とします。組み込まれたL1配列は5′末端で切断されることが多く、平均全長は1 Kbで、その多くは3′末端配列のみで構成されています。

レトロトランスポジションの性質は、L1にいくつかの独自の利点を与えている。L1レトロトランスポゾンは、挿入変異原がプロモーターから継続的に転写されるため、実質的に無制限に供給され、単一細胞で多数の変異が必要となる用途に有用である。L1要素はまた、広範囲のゲノムカバレッジを示し、挿入はほぼランダムに分布している。[ 36 ] [ 37 ] [ 38 ]ゲノム部位におけるL1挿入は不可逆的であるため、L1挿入によって引き起こされるあらゆる変異誘発イベントは、L1配列によって「タグ付け」される。

参照

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