アルデヒドタグ

アルデヒドタグは、蛍光体、グリカン、PEG（ポリエチレングリコール）鎖、または反応性基を追加してさらなる合成を可能にする短いペプチドタグです。 [ 1 ] LCxPxRというコンセンサス配列を持つ短い遺伝子コードペプチドを融合タンパク質に導入し、その後、ホルミルグリシン生成酵素（FGE）で処理することで、タグのシステインを反応性アルデヒド基に変換します。この求電子基は、アミノオキシ基やヒドラジド基で官能化された化合物など、様々なアルデヒド特異的試薬の標的となります。

発達

アルデヒドタグは、ホルミルグリシン生成酵素（FGE）によって認識される人工ペプチドタグです。ホルミルグリシンは、α炭素にホルミル基（-CHO）を有するグリシンです。[ 2 ]スルファターゼモチーフは、システインをホルミルグリシン残基に部位特異的に変換するペプチド配列の基礎となります。このペプチドタグは、様々な生物由来のスルファターゼにおけるFGE認識配列の研究により、細菌、古細菌、そして真核生物においてスルファターゼモチーフに高い相同性があることが明らかになったことを受けて設計されました。[ 3 ]

アルデヒドとケトンは求電子性の性質を持つため、化学レポーターとして用いられる。これらの性質により、強力な求核カップリングパートナーを用いることで、温和な条件下での反応が可能となる。典型的には、ヒドラジドとアミノオキシプローブは、生理的反応条件下で好ましいカルボニル基と安定化付加生成物を形成することで、バイオコンジュゲーションに用いられる。中性pHでは、シッフ塩基形成の平衡は反応物側に大きく傾いている。安定なヒドラゾンとオキシムを形成するために、化合物誘導体を用いてより多くの生成物を得る。触媒の毒性のために触媒を添加しても最適pHである4～6を達成できないため、生細胞内での反応は遅い。典型的な反応定数は10 −4～10 −3 M −1 s −1である。[ 4 ]

カルボニル基は、終止コドン抑制やアルデヒドタグ化などの様々な手法を用いて、化学レポーターとしてタンパク質に導入されます。 [ 3 ] [ 5 ]アルデヒドとケトンの使用を制限する要因として、特定の細胞環境におけるそれらの生体直交性の制限が挙げられます。アルデヒドとケトンを化学レポーターとして使用する際の制限には、以下のものがあります。

  • 代謝物および補因子中の内因性アルデヒドまたはケトンとの競合により、収量が低下し、特異性が低下します。
  • 酸化や内因性求核剤の望ましくない付加などの副反応。
  • 十分に安定した生成物を形成するプローブの制限されたセット。[ 6 ] [ 7 ]

したがって、アルデヒドとケトンは、そのような望ましくない副反応が低減される区画で使用するのが最適です。生細胞を用いた実験では、細胞表面と細胞外空間が典型的な反応場となります。しかしながら、カルボニル基の特徴は、求電子剤として関与する有機反応が極めて多いことです。これらの反応の中には、アルデヒドをプローブするためのライゲーション反応に容易に変換できるものもあります。Agarwalらによって最近バイオコンジュゲーションに用いられた反応は、ピクテ-スペングラー反応をライゲーション反応として応用したものです。この反応は天然物生合成経路から知られており[ 8 ]、新しい炭素-炭素結合を形成するという大きな利点があります。これにより、同様の反応速度論を持つ炭素-ヘテロ原子結合と比較して、長期的な安定性が保証されます[ 9 ] 。

FGEによるシステイン、あるいは稀にセリンの修飾[ 10 ]は、 1990年代後半に発見された珍しい翻訳後修飾である。 [ 11 ] FGEの欠損は、スルファターゼが機能を果たすために不可欠なα-ホルミルグリシンの形成を欠くため、機能的なスルファターゼの全体的な欠損につながる。FGEはタンパク質修飾に不可欠であり、高い特異性と変換率がネイティブな設定で必要となるため、この反応は化学生物学および合成生物学に応用できる。[ 12 ]

アルデヒドタグは、2007年に初めて目的のタンパク質の改変スルファターゼモチーフペプチドに挿入されました。[ 13 ]それ以来、バイオオルソゴナルアプリケーションにおける化学レポーターとしてのアルデヒドとケトンの同様の使用は、細胞溶解薬の自己組織化、[ 14 ]タンパク質の標的化、[ 15 ] [ 5 ]グリカン[ 16 ]およびヘテロ二機能性融合タンパク質の調製において実証されています。[ 17 ]

アルデヒドタグを遺伝的にコード化する

ホルミルグリシンタグまたはアルデヒドタグは、目的のタンパク質に融合される便利な6または13アミノ酸長のタグです。6-merタグは小さなコアコンセンサス配列を表し、13-merタグはより長い完全モチーフを表します。遺伝的にコード化されたアルデヒドタグの実験では、コアコンセンサス配列のみが存在する場合に高い変換効率が明確に示されました。4つのタンパク質が大腸菌で組み換え生成され、完全長モチーフの場合は86%の効率、6-merの場合は質量分析によって測定された90%を超える効率でした。[ 3 ] 配列のサイズは、一般的に使用される6x His-Tagと類似しており[ 18 ] 、遺伝的にコード化できるという利点があります。配列は、一次配列のみに応じてERで認識され、その後FGEによって標的とされます。[ 11 ]特に、大腸菌での組換え発現タンパク質のセットアップでは、外因性FGEの共発現が完全な変換を助けますが、 [ 3 ]大腸菌は内因性FGE活性を持っています。[ 19 ] アルデヒドタグの導入には、3つのセグメントで構成されるワークフローがあります。Aスルファターゼモチーフに由来するペプチドタグを持つ融合タンパク質の発現、B Cysからf(Gly)への酵素変換、Cヒドラジドまたはアルコキシアミンによるバイオオルソゴナルプロービング（図1）。

図1：ホルミルグリシンアルデヒドタグ Carrico et al.: [ 3 ] Aアルデヒドタグは、目的のタンパク質に遺伝的に挿入されます。この例では、最初に調べた4つのタンパク質のうちの1つであるヒト成長ホルモン（hGH、PDB:1HUW）を示しています。タンパク質のN末端はホルミルグリシンアルデヒドタグに融合されています。B FGEはモチーフを認識し、システイン（Cys）残基はホルミルグリシン残基[f(Gly)]に変換されます。化学レポーターは、酵素反応によってその場で生成されます。Cカルボニル基は、通常、ヒドラジドまたはアルコキシアミン官能化色素またはその他の化合物を使用してプローブされます。

図1に示すように、改変されたアルデヒドタグは6つのアミノ酸で構成されています。あらゆる生命ドメインから生物種を選択し、スルファターゼモチーフの配列相同性を決定しました。使用された配列は、細菌、古細菌、蠕虫、および高等脊椎動物に見られる配列の最良のコンセンサスです。[ 3 ]

システイン-ホルミルグリシン変換のFGEメカニズム

FGE の触媒機構は十分に研究されている。共有結合した酵素: 基質中間体による多段階の酸化還元反応が提案されている。発生する変換におけるシステイン残基の役割を、システインをアラニンに変異させることで研究した。変異したペプチドタグを使用した場合、質量分析法を使用しても変換は見られなかった。[ 3 ]この機構は、図 2に示すように、f(Gly) の形成におけるシステインの酸化還元活性チオール基の重要な役割を示している。触媒サイクルの重要なステップは、酵素のシステイン残基の一酸化であり、反応性のスルフェン酸中間体が形成される。続いて、ヒドロキシル基が基質のシステインに転移され、 H 2 O のヘテロ類似のβ 脱離の後、チオアルデヒドが形成される。この化合物は非常に反応性が高く、容易に加水分解され、アルデヒドとH 2 S分子を放出する。[ 20 ] [ 21 ] [ 12 ]

図 2： Dierks らによる FGE による Cys から f(Gly) への変換：[ 12 ]基質Iが FGE に結合し、ジスルフィド異性化IIbが起こる。FGE の Cys 341はスルフェン酸IIcに酸化される。ヒドロキシル基が基質に転移し、基質スルフェン酸IIIが生成される。水の β 脱離によりチオアルデヒド IVが生成され、これはすぐに水和してVになり、H 2 S が脱離した後、アルデヒドVIが形成される。アルデヒドVIと比較したチオアルデヒドIVの反応性が高く、水和物Vを形成する傾向があるため、平衡は生成物側に大きく傾く。Cys Subs = スルファターゼ モチーフに埋め込まれた基質タンパク質システイン。

アプリケーション

アルデヒドタグは、バイオ直交化学レポーターの導入により、最近応用が広がっている技術です。バイオ直交剤は、細胞内に天然には存在しないアジドやシクロオクチンなどの官能基を結合のために含みます。異物であるため不活性に見え、天然の代謝を妨げません。[ 3 ] [ 7 ] [ 9 ]図3は、ホルミルグリシンの可能な標識付け方法の概要を示しています。例えば、ビオチンなどのプローブやFlagなどのタンパク質タグに結合でき、精製や検出に便利です。[ 3 ] [ 1 ]さらに、蛍光体を生細胞イメージング用に直接結合させることもできます。[ 22 ]ポリエチレングリコール（PEG）鎖を潜在的薬物候補に結合すると、体液中のプロテアーゼに対する安定性が高まり、同時に腎クリアランスと免疫原性が低下します。[ 3 ]ここで述べる最初の応用は、バイオオルソゴナルプローブを介したタンパク質-タンパク質複合体の形成に関するものである。[ 23 ]アルデヒドタグは厳密に言えば真のバイオオルソゴナル剤ではないため、様々な代謝物中に存在し、タンパク質標識中に交差反応を引き起こす可能性がある。[ 16 ] [ 23 ]しかし、アジドやシクロオクチンなどのバイオオルソゴナルプローブを結合させることで、この障害を克服することができる。[ 23 ] 2番目の応用として、タンパク質へのグリカン部分の結合についてここで紹介する。これは、化学的に導入されたグリコシル化パターンの戦略に利用できる。[ 24 ]

図3：ホルミルグリシンの可能な結合プローブ

銅フリークリックケミストリーによるタンパク質-タンパク質複合体の形成

研究では、アルデヒドタグを利用してタンパク質-タンパク質複合体を作製する戦略が検討されてきた。[ 23 ]その目的は、完全長ヒトIgG（hIgG）をヒト成長ホルモン（hGH）に結合させることであった。これらのタンパク質-タンパク質複合体は、タンパク質治療薬における血清半減期の点で単量体タンパク質よりも優れている可能性があり、さらに魅力的な二重結合特性を持っている。[ 24 ] タンパク質融合を達成するために、5残基のアルデヒドタグ（CxPxR）をhIgGとhGHに組み込んだ。hIgGでは、アルデヒドタグが2つの重鎖のC末端に導入され、2つの結合部位が可能になった。次に、タンパク質発現中にFGEがシステイン残基をホルミルグリシン（fGly）に酸化する。その後の結合ステップでは、銅を使用しないクリックケミストリーの戦略が選択された。歪み促進1,3-双極子付加環化反応によりシクロオクチンとアジドが共有結合を形成した（Cuフリーのアジド-アルキン付加環化反応とも呼ばれる）。[ 23 ]従って、アルデヒド含有タンパク質は、一方の端にアミノオキシ残基を持ち、もう一方の端にアジドまたはシクロオクチンを持つ異なるヘテロ二官能性リンカーとオキシム形成下で反応する。その結果、hIgGはシクロオクチン（ここではジベンゾアザシクロオクチン（DIBAC））を含むリンカーに、hGHはアジド官能基を持つリンカーに結合した（図2AおよびB）。タンパク質hGHおよびhIgGはDIBAC-488、アジドAlexa Fluor 647で処理し、オキシム形成を検証するためにSDS-PAGEおよびウエスタンブロットで分析した。次に、DIBAC-hIgG誘導体とアジド-hGH誘導体を銅フリークリックケミストリーで結合させます（図2C）。得られた融合タンパク質を精製し、免疫ブロット法で解析しました（Hudak et al. 2012参照）。

図4 ： hIgGとhGH のタンパク質間結合A )+ B ) アルデヒドタグ化タンパク質をアミノオキシアジド/シクロオクチン二官能性リンカーで処理し、オキシムを形成する。C ) DIBAC-hIgGおよびアジド-hGH複合体は、銅フリークリックケミストリーによってタンパク質三量体に結合される。XとYは異なる長さのPEGベースのリンカーである。

ウェスタンブロットは、まずポンソー染色で染色し、次に抗hGHIgG抗体とインキュベートした後、α-mIgG HRPおよびα-hIgG 647で処理して可視化した。hIgG-hGHコンジュゲートウェスタンブロット（非還元条件）では、免疫検出後に分子量の異なる2つの別々のバンドが観察された。これらは、hIgGへのモノコンジュゲートおよびバイコンジュゲートhGHの形成に寄与している可能性がある。

IgG Fcフラグメントの化学的グリコシル化

自然は数千年をかけて、酵素と炭水化物の複雑な相互作用を通じてタンパク質のグリコシル化を完璧に成し遂げてきました。しかし、化学的なグリコシル化は、グリカン全般の合成が難しいため、依然として障壁となっています。[ 25 ]炭水化物誘導体の合成は時間がかかり、面倒な場合があります。[ 26 ]それでも、タンパク質のグリコシル化を構造的に模倣する技術への関心は、タンパク質の機能の一部が結合したグリカンのパターンにのみ依存するため、魅力的な応用分野です。[ 27 ]例えば、IgG抗体のFcフラグメントは、高度に保存されたNグリコシル化部位を持つホモ二量体です。結合した糖部分は特定の免疫受容体への結合を調節し、それによって抗体全体の機能を変化させます。[ 28 ] [ 29 ]

スミスらは、グリカンの化学結合部位としてのアルデヒドタグの応用を実証している。[ 22 ]アルデヒドタグ配列をFc構築物に組み込んで、CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に導入した。コントロールとして、システイン残基がアラニンに変異した遺伝子構築物を使用した。発現後、Fcタンパク質をプロテインA / Gアガロースカラムで精製した。CHO細胞でのシステインのホルミルグリシンへの変換を、アミノオキシAlexaFluor 488とそれに続くSDS-PAGEで調べた。しかし、蛍光スキャンでは蛍光標識は示されず、CHO細胞での内因性FGEによるホルミルグリシンの形成は見られなかった。次に、改変されていないタンパク質をin vitroでMycobacterium tuberculosis由来の組み換えFGEで処理したところ、アルデヒド基がFcのグリコシル化部位にうまく導入された（図3A）。

次に、アミノオキシGlcNAc（AO-GlcNAc）処理により、アルデヒドタグタンパク質へのオキシム形成を介したN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の導入を行った（図3B）。結合は、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化質量分析（LC-ESI-MS）およびAlexaFluor 647に結合したGlcNAc結合性小麦胚芽凝集素を用いたレクチンブロットによって確認された。GlcNAcの導入に成功した後、モノマーはGlcNAc、マンノース（Man）、およびガラクトース（Gal）を含むグリカン構造で伸長した（図3C）。 IgG Fc N結合型GlcNAc残基に高い特異性を示し、他のタンパク質や変性IgGのAsn-GlcNAc部位を伸長させない変異型エンドグリコシダーゼEndoS（EndoS-D233Q）を使用しました。生成物の形成は、シアル酸結合性のニワトコ（sambucus nigra）凝集素をフルオレセインイソチオシアネートに結合させ、LC-ESI-MSおよびレクチンブロットプロービングによって再度モニタリングしました。

Fc IgG断片の化学的グリコシル化に成功し、これは天然のグリコシル化パターンに類似している。上記の研究はIgG抗体に焦点を当てているが、アルデヒドタグを用いたグリカン結合の応用は他のタンパク質にも拡張できる可能性がある。[ 22 ]

図5 ： IgG Fcフラグメント（鎖AおよびB）の化学的グリコシル化グリコシル化部位A）ホルミルグリシン生成酵素（FGE）はシステイン残基をアルデヒド基に酸化するB）アミノオキシ-N-アセチルグルコースアミン（AO-GlcNAc）はオキシム形成を介してFcに結合するC）GlcNAcはエンドグリコシダーゼEndoS（EndoS-D233Q）の助けを借りて、異なる炭水化物部分によってさらに伸長する

参考文献

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