タンパク質のゲル電気泳動
SDS-PAGE、クマシーブリリアントブルー染色により分離されたタンパク質

タンパク質電気泳動は、液体または抽出物中のタンパク質を分析する方法です。電気泳動は、アガロースやポリアクリルアミドなどの支持媒体の有無にかかわらず、いくつかの代替方法で少量のサンプルで行うことができます。ゲル電気泳動の変種には、 SDS-PAGE、フリーフロー電気泳動、電気フォーカシング、等速電気泳動、アフィニティー電気泳動、免疫電気泳動、対比電気泳動、キャピラリー電気泳動などがあります。各変種には多くのサブタイプがあり、それぞれに利点と限界があります。ゲル電気泳動は、特定のタンパク質に関する追加情報を得るために、エレクトロブロッティングやイムノブロッティングと組み合わせて行われることがよくあります。 [ 1 ]

変性ゲル法

SDSページ

SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、変性（折り畳まれていない）状態のタンパク質を電気泳動移動度（ポリペプチド鎖の分子量の関数）に基づいて分離するための関連技術の集合体です。ほとんどのタンパク質では、SDSがポリペプチド鎖に結合することで、単位質量あたりの電荷が均一に分布し、電気泳動中におおよそのサイズで分画されます。[ 2 ]

SDSは強力な界面活性剤であり、天然タンパク質を変性させて折り畳まれていない個々のポリペプチドへと分解するために使用される。タンパク質混合物をSDS存在下で100℃に加熱すると、界面活性剤がポリペプチド骨格に巻き付く。この過程で、ポリペプチドの固有電荷はSDSが付与する負電荷と比較して無視できるほど小さくなる。したがって、処理後のポリペプチドは均一な電荷密度、すなわち単位長さあたりの正味負電荷を有する棒状構造となる。これらのタンパク質の電気泳動移動度は、分子量の対数の線形関数となる。 [ 3 ]

ネイティブゲル法

非変性ゲルとしても知られるネイティブゲルは、タンパク質をまだ折り畳まれた状態のまま分析します。したがって、電気泳動移動度は、電荷質量比だけでなく、タンパク質の物理的形状、サイズ、等電点にも依存します。[ 4 ]

ブルーネイティブページ

BN-PAGEは、クマシーブリリアントブルー色素がタンパク質複合体に電気泳動分離に必要な電荷を与えるネイティブPAGE法です。 [ 5 ] [ 6 ]クマシー色素の欠点は、タンパク質に結合すると洗剤のように作用し、複合体を解離させることです。もう一つの欠点は、化学発光（例えば、その後のウェスタンブロット検出や活性アッセイにおいて）や、補欠分子族（ヘムやクロロフィルなど）を持つタンパク質、あるいは蛍光色素で標識されたタンパク質の蛍光が消光する可能性があることです。

クリアネイティブPAGE

CN-PAGE（一般にネイティブPAGEと呼ばれる）は、ポリアクリルアミドグラジエントゲル中で酸性水溶性タンパク質と膜タンパク質を分離します。荷電色素を使用しないため、CN-PAGEにおけるタンパク質の電気泳動移動度は（電荷シフト法のBN-PAGEとは対照的に）タンパク質の固有電荷と関連しています。[ 7 ]移動距離はタンパク質の電荷、サイズ、ゲルの細孔径に依存します。多くの場合、この方法はBN-PAGEよりも分解能が低くなりますが、クマシー色素がさらなる分析技術に干渉するような場合にはCN-PAGEに利点があり、例えばFRET分析のための非常に効率的なマイクロスケール分離技術として説明されています。[ 8 ]さらに、CN-PAGEはBN-PAGEのような過酷な条件を必要としないため、BN -PAGEでは解離してしまう膜タンパク質複合体の超分子集合体を保持することができます[ 7 ]しかし、マトリックス抽出中に洗剤を使用すると、天然の膜タンパク質が解離する可能性があり、勾配ゲルは分離された可溶性タンパク質の変性に寄与する可能性がある。

調製用ネイティブPAGE

対象となる折り畳まれたタンパク質複合体は、ポリアクリルアミドゲル、電気泳動緩衝液、電気泳動装置、およびその他の標準パラメータの特定の特性により、変性のリスクなしに、きれいにかつ予測通りに分離されます。分離された（金属）タンパク質は生理学的溶出液に連続的に溶出され、フラク​​ションコレクターに送られます。4～5つのPAGEフラクションごとに、異なる金属イオン補因子を同定し、高解像度ICP-MSによって絶対定量することができます。これらのフラクションのアリコート中の分離された金属タンパク質の関連する機能的3D構造は、溶液NMR分光法によって特異的に決定できます。[ 9 ]

緩衝液システム

レムリゲルシステムにおけるタンパク質の想定される移動 A：濃縮ゲル、B：分離ゲル、o：サンプル塗布、c：緩衝液と電気泳動マトリックスの不連続性

ほとんどのタンパク質分離は、ゲル内のバンドの鮮明度を大幅に向上させる「不連続」（DISC）緩衝液システムを用いて行われます。不連続ゲルシステムでの電気泳動では、泳動の初期段階でイオン勾配が形成され、すべてのタンパク質が単一の鮮明なバンドに集束します。このイオン勾配の形成は、緩衝液のイオンがSDS被覆タンパク質と比較して中程度の電荷しか持たないpH値を選択することにより実現されます。これらの条件は、コールラウシュ反応によってモル伝導度が決定される環境を提供します。その結果、SDS被覆タンパク質は数分以内に19μm程度の薄い領域に数倍濃縮されます。この段階では、すべてのタンパク質は等速電気泳動によって同じ移動速度で移動します。これは、ゲルのより大きな細孔を持つ領域で起こるため、集束または「スタッキング」中にゲルマトリックスが移動を遅らせることはありません。[ 10 ] [ 11 ]タンパク質のサイズによる分離は、ゲルの下層、つまり「分離」領域で行われます。分離ゲルは通常、はるかに小さな細孔径を有しており、これがふるい分け効果をもたらし、タンパク質の電気泳動移動度を決定します。同時に、ゲルの分離領域では、緩衝液中のイオンが平均的により大きな電荷を帯びるようなpH値を持ち、SDSで覆われたタンパク質を「追い越して」イオン勾配を解消し、スタッキング効果を排除します。

非常に広く普及している不連続緩衝系は、トリス-グリシン緩衝液または「レムリ」緩衝液であり、pH 6.8で積層し、pH 8.3～9.0で分離します。この緩衝液の欠点は、システインのpKaが8～9の範囲にあり、ローディング緩衝液中の還元剤がタンパク質と共移動しないため、これらのpH値ではタンパク質中のシステイン残基間のジスルフィド結合形成が促進される可能性があることです。近年の緩衝技術の進歩により、システインのpKaよりもはるかに低いpH（例えば、ビス-トリス、pH 6.5）でタンパク質を分離し、還元環境を維持するためにタンパク質よりも先にゲル内に移行する還元剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム）を使用することで、この問題は軽減されています。低pH緩衝液を使用することのさらなる利点は、アクリルアミドゲルが低いpH値でより安定するため、使用前にゲルを長期間保存できることです。[ 12 ] [ 13 ]

タンパク質のSDS勾配ゲル電気泳動

電圧が印加されると、陰イオン（および負に帯電したサンプル分子）は下部チャンバーの陽極（アノード）に向かって移動し、先行イオンはCl − （高移動度および高濃度）です。グリシン酸は後続イオンです（低移動度および低濃度）。SDSタンパク質粒子は、ゲル緩衝液のCl −と陰極緩衝液のGly −との間の境界で自由に移動しません。フリードリヒ・コールラウシュは、オームの法則が溶解した電解質にも適用されることを発見しました。Cl −およびグリシン緩衝液間の電圧降下により、タンパク質はマイクロメートルの薄い層に圧縮（積み重ね）されます。[ 14 ]境界は細孔勾配を通って移動し、ゲルマトリックスの摩擦抵抗の増加によりタンパク質の積み重ねは徐々に分散します。スタッキングとスタッキング解除は、異なる位置にあるタンパク質ごとに、勾配ゲル内で継続的に発生します。タンパク質の完全な分離には、ポリアクリルアミドゲルの濃度が16% Tを超える必要がある。「Laemmli」の2ゲルシステムは、単純なグラジエントゲルである。緩衝液のpHの不連続性は分離品質に影響を与えず、異なるpHを持つ「スタッキングゲル」は必要ない。[ 15 ]

視覚化

最も一般的なタンパク質染色法はクマシーブリリアントブルーです。これは陰イオン性色素で、タンパク質に非特異的に結合します。ゲル中のタンパク質は酢酸で固定され、同時に染色されます。ゲルに取り込まれた余分な色素は、色素を含まない同じ溶液で脱色することで除去できます。タンパク質は透明な背景に青いバンドとして検出されます。[ 16 ] [ 17 ]

クマシー染色よりも高感度な染色法が必要な場合、通常は銀染色が用いられます。銀染色はゲル中の微量タンパク質を検出する感度の高い手法ですが、核酸や多糖類も染色可能です。[ 17 ]

クマシー染色や銀染色などの染色剤を使用しない可視化法も市販されています。[ 18 ]例えば、バイオ・ラッド・ラボラトリーズはSDS-PAGEゲル電気泳動用の「染色フリー」ゲルを販売しています。また、Azure Biosystems社のAzureRedやAzure TotalStain Qなどの可逆性蛍光色素も使用できます。[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]

核酸ゲル電気泳動と同様に、トラッキング色素がよく用いられます。サンプルバッファーには、電気泳動移動度が既知の陰イオン性色素が通常含まれています。非常に一般的なトラッキング色素はブロモフェノールブルーです。この色素はアルカリ性および中性pHで発色し、負に帯電した小さな分子で、陽極に向かって移動します。移動性の高い分子であるため、ほとんどのタンパク質よりも先に進み、移動します。[ 20 ]

医療用途

タンパク質電気泳動ゲルの模式図
多発性骨髄腫患者の血清タンパク質電気泳動で、異常タンパク質（ガンマゾーンのピーク）が示されています

医学において、タンパク質電気泳動は主に血清中のタンパク質を分析する方法です。ゲル電気泳動が広く使用されるようになる以前は、タンパク質電気泳動はフリーフロー電気泳動（紙上）または免疫電気泳動として行われていました。

伝統的に、血液タンパク質は血清アルブミンとグロブリンの2種類に分類されます。これらの割合は概ね同程度ですが、分子としてのアルブミンははるかに小さく、負に弱く帯電しているため、電気泳動ゲル上でアルブミンが蓄積します。アルブミンの前に現れる小さなバンドはトランスサイレチン（プレアルブミンとも呼ばれます）です。一部の薬剤や体内化学物質も独自のバンドを生じさせますが、通常は小さなものです。異常なバンド（スパイク）は、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症や多発性骨髄腫で見られ、これらの疾患の診断に役立ちます。

グロブリンはそのバンドパターン（主な代表例）によって分類されます。

関連項目

参考文献

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