イースタンブロット

イースタンブロット（またはイースタンブロッティング）は、脂質、リン酸、複合糖質の付加を含むタンパク質の翻訳後修飾を解析する生化学的手法です。最もよく用いられるのは糖鎖エピトープの検出です。したがって、イースタンブロットはウェスタンブロットの生化学的手法の延長線上にあると考えることができます。「イースタンブロット」という用語で説明される手法は複数ありますが、そのほとんどは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲルからポリフッ化ビニリデンまたはニトロセルロース膜にブロッティングしたリン酸化タンパク質を使用します。転写されたタンパク質は、脂質、糖質、リン酸化、またはその他のタンパク質修飾を検出できるプローブを用いて、翻訳後修飾の有無について解析されます。イースタンブロットは、翻訳後修飾とプローブの特異的な相互作用を介して標的を検出する手法を指し、標準的なファーウェスタンブロットとは区別されます。原理的には、イースタンブロッティングはレクチンブロッティング（すなわち、タンパク質または脂質上の炭水化物エピトープの検出）に似ている。 [ 1 ]

歴史と多様な定義

イースタンブロットという用語の定義は、複数の著者が新しい手法をイースタンブロット、あるいはその派生語と呼んでいるため、やや混乱を招いています。これらの定義はすべて、1979年にトウビンによって開発されたウエスタンブロットという手法から派生したものです。 [ 2 ]現在の定義は、名称が最初に使用された順に以下にまとめられていますが、いずれも以前の研究に基づいています。場合によっては、この用語が導入される以前から、この手法が実際に使用されていたこともあります。

  • （1982）イースタンブロッティングという用語は、2つの別々のグループによって明確に否定されました。ラインハートとマラマッドは、ネイティブゲルのタンパク質ブロットをネイティブブロットと呼びました。[ 3 ]ペフェロエンらは、ドデシル硫酸ナトリウムゲルで分離されたタンパク質を真空を使用してニトロセルロースに引き寄せる方法を真空ブロッティングと呼ぶことを選択しました。[ 4 ] [ 5 ]
  • (1984)中東ブロッティングは、ポリA RNA（アガロースで分離）をブロットし、これを固定化する手法として説明されている。固定化されたRNAは、DNAを用いてプローブされる。[ 6 ]
  • (1996)イースタン・ウェスタン・ブロット法は、ボグダノフらによって初めて用いられた[ 7 ]。この方法は、ポリフッ化ビニリデン膜またはニトロセルロース膜にリン脂質をブロッティングした後、従来のウェスタンブロッティング法を用いて同じニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、コンフォメーション特異的抗体でプローブするものである。この方法は、1994年にタキらがTLCブロッティングと名付けた研究[ 8 ]に基づいており、さらに1984年にトウビンが導入した同様の方法に基づいている[ 9 ]。
  • （2000）ファーイースタンブロッティングは、2000年に石川と滝によって初めて命名されたようです。[ 10 ]この方法はファーイースタンブロットの記事でより詳細に説明されていますが、ポリフッ化ビニリデン膜に転写された脂質の抗体またはレクチン染色に基づいています。
  • (2001)イースタンブロッティングは、BSAをポリフッ化ビニリデンメンブレンにブロッティングし、過ヨウ素酸処理を施すことで生成される複合糖質を検出する技術として説明された。酸化タンパク質は複合混合物で処理され、メンブレン上に新たな複合糖質が生成される。その後、メンブレンは目的のエピトープに対する抗体でプローブされる。[ 11 ]この方法は、同じグループによるその後の研究でも議論されている。[ 12 ] [ 13 ]この方法は本質的にはファーイースタンブロットである。[ 14 ]
  • （2002）イースタンブロットは、 PAGEゲルから逆極性で泳動したタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜にブロットして行う免疫ブロット法を指すこともある。[ 15 ]これは本質的にはウエスタンブロットであるため、電荷反転を利用してこの方法をイースタンブロットと名付けた。[ 16 ] [ 17 ]
  • （2005）イースタンブロットは、抗体ではなくアプタマーをプローブとして、ポリフッ化ビニリデン膜上にタンパク質をブロットする方法です。 [ 18 ]これはサザンブロットに似ているように見えますが、相互作用は2つのDNA分子ではなく、DNA分子（アプタマー）とタンパク質の間で起こります。[ 19 ]この方法はサウスウェスタンブロットに似ています。
  • (2006)イースタンブロッティングは、相補性を利用した融合タンパク質の検出を指すために用いられてきました。この名称は、検出に酵素活性化因子（EA）を用いることに由来しています。[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]
  • （2009）イースタンブロッティングは、最近トーマスらによって、ポリフッ化ビニリデン膜にブロットされたタンパク質をレクチン、コレラ毒素、化学染色剤でプローブし、グリコシル化、リポイル化、またはリン酸化タンパク質を検出する技術として再命名されました。[ 14 ]著者らは、レクチンプローブや他の染色試薬を使用する点で、タキらによって命名されたファーイースタンブロット[ 10 ]とこの方法を区別しています。
  • （2009）イースタンブロットは、抗体ではなくアプタマーをプローブとしてニトロセルロース膜上にタンパク質をブロットする方法である。 [ 23 ]この方法はサウスウェスタンブロットに似ている。
  • （2011）最近の研究では、コンカナバリンAなどのレクチンを用いた糖タンパク質の検出をイースタンブロッティングという用語で表現した[ 24 ]

この用語には、明らかに統一された定義はありません。最近の注目記事[ 25 ]では、サザンブロット法の創始者であるエド・サザン氏にインタビューを行い、田中ら[ 12 ]によるイースタンブロット法の改名について言及しています。記事では、イースタンブロット法を「妖精、ユニコーン、そして無料の昼食」に例え、「イースタンブロット法は存在しない」と述べています。イースタンブロット法は、一般的なブロット法（サザン法、ノーザン法、ウエスタン法）を比較した免疫学の教科書にも記載されており、「しかしながら、イースタンブロット法は試験問題にしか登場しない」とされています。[ 26 ]

イースタンブロッティングによる糖鎖検出の原理は、タンパク質の糖化を検出するためにレクチンが用いられたことに遡ります。この検出法の最も初期の例は、1976年のTannerとAnsteeによるもので、レクチンを用いてヒト赤血球から単離された糖化タンパク質を検出しました。[ 27 ]ブロッティングによる糖化の特異的検出は、通常、レクチンブロッティングと呼ばれます。このプロトコルの最近の改良点の概要は、H. Freezeによって提供されています。[ 1 ]

アプリケーション

この技術の応用例の一つとして、2種類の細菌種であるEhrlichia属細菌（E. murisとIOE）におけるタンパク質修飾の検出が挙げられます。タンパク質修飾の検出には、コレラ毒素Bサブユニット（ガングリオシドに結合する）、コンカナバリンA（マンノース含有グリカンを検出する）、およびニトロホスホモリブデートメチルグリーン（リン酸化タンパク質を検出する）が用いられました。この技術により、非毒性のE. murisの抗原タンパク質は、毒性の強いIOEよりも翻訳後修飾が進んでいることが示されました。[ 14 ]

意義

mRNAから翻訳されるタンパク質のほとんどは、細胞内で機能を発揮する前に修飾を受けます。これらの修飾は総称して翻訳後修飾と呼ばれます。生理学的条件下では安定している新生タンパク質、あるいは折り畳まれたタンパク質は、その後、側鎖または骨格において、特定の酵素触媒による一連の修飾を受けます。

タンパク質の翻訳後修飾には、アセチル化、アシル化（ミリストイル化、パルミトイル化）、アルキル化、アルギニル化、ADP-リボシル化、ビオチン化、ホルミル化、ゲラニルゲラニル化、グルタミル化、グリコシル化、グリシル化、水酸化、イソプレニル化、ラクチル化、リポイル化、メチル化、ニトロアルキル化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、セレン化、S-ニトロシル化、サクシニル化、硫酸化、トランスグルタミネーション、スルフィニル化、スルホニル化、ユビキチン化（SUMO化、NEDD化）が含まれます。[ 28 ] [ 29 ]

アミノ酸鎖のN末端で起こる翻訳後修飾は、生体膜を通過する際に重要な役割を果たします。これには、原核生物および真核生物の分泌タンパク質、そしてリソソーム、葉緑体、ミトコンドリア、細胞膜といった様々な細胞膜や細胞小器官に取り込まれることを意図したタンパク質が含まれます。翻訳後タンパク質の発現は、いくつかの疾患において重要です。

参照

参考文献

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