蛍光分光法
水銀測定用原子蛍光分光分析装置

蛍光分光法（蛍光定量法または分光蛍光定量法とも呼ばれる）は、試料からの蛍光を分析する電磁分光法の一種です。通常は紫外線などの光線を用いて、特定の化合物の分子内の電子を励起し、発光させます。発光は通常は可視光ですが、必ずしも可視光とは限りません。相補的な手法として吸光分光法があります。単分子蛍光分光法という特殊なケースでは、単一の蛍光体、または蛍光体ペアから放出される光の強度変動を測定します。

蛍光を測定する装置は蛍光計と呼ばれます。

理論

分子はエネルギー準位と呼ばれる様々な状態を持ちます。蛍光分光法は、主に電子状態と振動状態に着目します。一般的に、分析対象となる分子種は、基底電子状態（低エネルギー状態）と、より高いエネルギーの励起電子状態を有します。これらの電子状態それぞれには、様々な振動状態が存在します。[ 1 ]

蛍光においては、まず分子は光子を吸収することで基底電子状態から励起電子状態における様々な振動状態のいずれかへと励起されます。他の分子との衝突により、励起分子は振動エネルギーを失い、励起電子状態の最低振動状態に達します。この過程は、しばしばヤブロンスキー図で視覚化されます。[ 1 ]

その後、分子は再び基底電子状態の様々な振動準位のいずれかに落ち込み、その過程で光子を放出します。[ 1 ]分子は基底状態の複数の振動準位のいずれかに落ちるため、放出される光子は異なるエネルギー、ひいては異なる周波数を持ちます。したがって、蛍光分光法で放出される光の異なる周波数とその相対強度を分析することで、異なる振動準位の構造を決定することができます。

原子種の場合もプロセスは同様ですが、原子種は振動エネルギー準位を持たないため、放出される光子は入射光と同じ波長であることが多いです。吸収された光子を再放出するこのプロセスは「共鳴蛍光」と呼ばれ、原子蛍光の特徴であるだけでなく、分子蛍光にも見られます。[ 2 ]

一般的な蛍光（発光）測定では、励起波長（蛍光体を励起するために使用される入射光の波長）は固定されており、検出波長が変化します（発光スペクトルが生成されます）。一方、蛍光励起測定では、検出波長は固定されており、励起波長は対象領域全体で変化して励起スペクトルが生成されます。励起-発光マトリックスは、さまざまな励起波長から得られる発光スペクトルを記録し、それらをすべて組み合わせることで得られます。[ 3 ] [ 4 ]これは、励起波長と発光波長の関数としての発光強度の3次元表面データセットであり、通常は等高線マップとして表されます。

計装

一般的に、フィルターを使用して入射光と蛍光を分離するフィルター蛍光計と、回折格子モノクロメーターを使用して 入射光と蛍光を分離する分光 蛍光計の 2 種類の計測器があります。

どちらのタイプも、以下の原理を採用しています。励起光源からの光はフィルターまたはモノクロメーターを通過し、サンプルに照射されます。入射光の一部はサンプルに吸収され、サンプル中の分子の一部が蛍光を発します。蛍光は全方向に放射されます。この蛍光の一部は、2つ目のフィルターまたはモノクロメーターを通過し、検出器に到達します。検出器は通常、入射光ビームに対して90°の角度で配置されます。これは、透過光または反射光が検出器に到達するリスクを最小限に抑えるためです。

蛍光計のコンポーネントのシンプルな設計

励起光源としては、レーザー、LED、ランプなど様々な光源が使用可能です。特にキセノンアークや水銀灯が優れています。レーザーは、通常0.01nm未満の非常に狭い波長範囲でのみ高放射照度の光を放射するため、励起用モノクロメーターやフィルターは不要です。この方法の欠点は、レーザーの波長を大きく変化させることができないことです。水銀灯はラインランプであり、ピーク波長付近の光を放射します。一方、キセノンアークは、300～800nmの範囲でほぼ一定の強度で連続的に発光するスペクトルを持ち、200nmをわずかに超える波長まで測定するのに十分な放射照度を備えています。

蛍光分光計では、フィルターやモノクロメーターが使用される場合があります。モノクロメーターは、調整可能な波長と許容誤差を持つ光を透過します。最も一般的なモノクロメーターは回折格子を利用したもので、コリメートされた光が格子を照射し、波長に応じて異なる角度で出射します。モノクロメーターを調整することで、透過する波長を選択できます。異方性測定を可能にするには、2つの偏光フィルターを追加する必要があります。1つは励起モノクロメーターまたはフィルターの後、もう1つは発光モノクロメーターまたはフィルターの前です。

前述のように、蛍光は励起光に対して90°の角度で測定されることが最も多い。透過した励起光の干渉を避けるために、励起光のラインにセンサーを180°の角度で配置する代わりに、この配置が用いられる。モノクロメーターは完璧ではなく、迷光、つまり対象波長以外の波長の光を透過してしまう。理想的なモノクロメーターは、指定された範囲の光のみを透過し、波長に依存しない高い透過率を持つ。90°の角度で測定する場合、サンプルによって散乱された光のみが迷光を引き起こす。その結果、信号対雑音比が向上し、180°配置と比較して検出限界が約10000分の1に低下する[ 5 ]。さらに、蛍光は正面から測定することも可能であり、これは濁ったサンプルや不透明なサンプルでよく行われる[ 6 ] 。

検出器はシングルチャンネル型とマルチチャンネル型のいずれかを選択できます。シングルチャンネル型検出器は一度に1つの波長の強度しか検出できませんが、マルチチャンネル型検出器はすべての波長の強度を同時に検出できるため、発光モノクロメータやフィルターは不要です。

最も汎用性の高い蛍光計は、デュアルモノクロメータと連続励起光源を備え、励起スペクトルと蛍光スペクトルの両方を記録できます。蛍光スペクトルの測定では、励起光の波長は一定に保たれ、できれば吸収率の高い波長に設定され、発光モノクロメータがスペクトルを走査します。励起スペクトルの測定では、発光フィルターまたはモノクロメータを通過する波長は一定に保たれ、励起モノクロメータがスペクトルを走査します。蛍光強度は吸収に比例するため、励起スペクトルは一般に吸収スペクトルと一致します。[ 7 ]

データの分析

OpenChromからのGNU Rエクスポート
OpenChromのOpenFluorプラグインによる物質マッチングの表示[ 8 ]

低濃度では、蛍光強度は通常、蛍光体の濃度に比例します。

UV/可視分光法とは異なり、装置に依存しない「標準」スペクトルを得ることは容易ではありません。スペクトルには様々な要因が影響を及ぼし、歪みが生じるため、「真の」、つまり装置に依存しないスペクトルを得るには補正が必要です。ここでは、様々な種類の歪みを装置に起因するものとサンプルに起因するものとに分類します。まず、装置に起因する歪みについて説明します。まず、光源の強度と波長特性は、実験中および実験間で時間とともに変化します。さらに、すべての波長で一定の強度を持つランプは存在しません。これを補正するために、励起モノクロメータまたはフィルターの後にビームスプリッターを適用し、光の一部をリファレンス検出器に導くことができます。

さらに、モノクロメータとフィルターの透過効率も考慮する必要があります。これらも経時的に変化する可能性があります。モノクロメータの透過効率も波長によって異なります。そのため、励起モノクロメータまたはフィルターの後段に、オプションでリファレンス検出器を設置する必要があります。検出器が検出する蛍光の割合もシステムに依存します。さらに、検出器の量子効率、つまり検出される光子の割合は、検出器の種類、波長、そして時間経過によって変化します。これは、検出器が必然的に劣化するためです。

他に考慮すべき2つの点は、放射線を導くための光学系と、サンプル物質を保持または封入するための手段（キュベットまたはセルと呼ばれる）です。ほとんどのUV、可視光線、および近赤外（NIR）測定では、高精度の石英キュベットを使用する必要があります。どちらの場合も、対象とする波長範囲で比較的吸収の少ない材料を選択することが重要です。石英は200nm～2500nmの波長を透過するため理想的です。高品質の石英は3500nmまで透過できますが、他の材料は吸収特性によってサンプルからの蛍光が隠されてしまう可能性があります。

これらすべての機器要因を補正して「標準」スペクトルを得るのは面倒な作業であり、実際には厳密に必要な場合にのみ適用されます。例えば、量子収率を測定する場合や、発光強度が最大となる波長を見つける場合などがこれに該当します。

前述のように、サンプルからも歪みが生じます。したがって、サンプルのいくつかの側面も考慮する必要があります。まず、光分解により、時間の経過とともに蛍光の強度が低下する可能性があります。光の散乱も考慮する必要があります。この文脈で最も重要な散乱の種類は、レイリー散乱とラマン散乱です。レイリー散乱によって散乱された光は入射光と同じ波長ですが、ラマン散乱では散乱光の波長が通常より長波長に変わります。ラマン散乱は、励起光によって誘導される仮想電子状態の結果です。この仮想状態から、分子は振動基底状態以外の振動レベルに緩和する場合があります。[ 9 ]蛍光スペクトルでは、常に励起波数に対する一定の波数差で見られます。たとえば、水中では励起光よりも 3600 cm −1低い波数にピークが現れます。

他に考慮すべき点は、内部フィルター効果である。[ 10 ] [ 11 ]これらには再吸収が含まれる。再吸収は、蛍光体が放射を放出する波長で別の分子または高分子の一部が吸収することによって起こる。この場合、蛍光体から放出された光子の一部またはすべてが再び吸収される可能性がある。別の内部フィルター効果は、蛍光体を含む吸収分子の濃度が高いために発生する。その結果、励起光の強度は溶液全体で一定ではない。その結果、検出システムで可視となる蛍光体に到達する励起光はごくわずかになる。内部フィルター効果は放出される光のスペクトルと強度を変えるため、蛍光の発光スペクトルを分析する際には考慮する必要がある。[ 7 ] [ 12 ]

トリプトファン蛍光

折り畳まれたタンパク質の蛍光は、個々の芳香族残基からの蛍光が混ざったものである。折り畳まれたタンパク質の固有の蛍光発光のほとんどはトリプトファン残基の励起によるものであり、一部の発光はチロシンとフェニルアラニンによるものであるが、この波長域ではジスルフィド結合もかなりの吸収を持つ。典型的には、トリプトファンは最大吸収波長が 280 nm で、発光ピークは溶媒和発色性であり、局所環境の極性に応じて約 300～350 nm の範囲である[ 13 ] そのため、タンパク質の蛍光は、タンパク質の立体配座の状態を診断するために使用できる。[ 14 ] さらに、トリプトファンの蛍光は、他の残基の近さによって強く影響される（すなわち、近くのAsp や Glu などのプロトン化された基は、Trp の蛍光を消光する可能性がある）。また、トリプトファンと他の蛍光アミノ酸の間でエネルギー移動が起こる可能性があり、特にフェルスター酸性アプローチを採用する場合、分析に影響を与える可能性があります。さらに、トリプトファンは比較的希少なアミノ酸であり、多くのタンパク質には1つまたは数個のトリプトファン残基しか含まれていません。そのため、トリプトファン蛍光は、個々のトリプトファン残基の立体構造状態を非常に高感度に測定できる可能性があります。外因性プローブと比較した利点は、タンパク質自体が変化しないことです。タンパク質の立体構造研究における内因性蛍光の使用は、実際には、トリプトファン残基の数が少ない（または1つしかない）場合に限られます。これは、各残基が異なる局所環境にさらされ、異なる発光スペクトルが生じるためです。

トリプトファンは重要な固有蛍光（アミノ酸）であり、トリプトファンの微小環境の性質を推定するために使用できます。変性剤、界面活性剤、またはその他の両親媒性分子を使用して実験を行う場合、トリプトファンの微小環境が変化する可能性があります。たとえば、単一のトリプトファンを「疎水性」コアに含むタンパク質が温度の上昇で変性すると、赤方偏移した発光スペクトルが現れます。これは、トリプトファンが疎水性タンパク質内部ではなく水性環境にさらされているためです。対照的に、水性溶媒にさらされているトリプトファンを含むタンパク質に界面活性剤を追加すると、トリプトファンが界面活性剤小胞またはミセルに埋め込まれている場合は、青方偏移した発光スペクトルが発生します。[ 15 ]トリプトファンを欠くタンパク質は蛍光体と結合できます。

295 nm での蛍光励起では、トリプトファンの発光スペクトルが、より弱いチロシンとフェニルアラニンの蛍光よりも優勢になります。

時間分解蛍光タンパク質

時間分解蛍光タンパク質（TRFP）は、オワンクラゲ（Aequorea victoria ）由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）などの天然蛍光タンパク質に由来する生体分子です。TRFPは、 pHや分子間相互作用などの環境要因によって変化する限られた時間間隔（1～10ナノ秒）で蛍光を発します。2000年代初頭に着手されたTRFPは、自己蛍光を最小限に抑え、シグナルの多重化を可能にすることで、蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）の性能を向上させ、強度ベースの方法よりも優れたコントラストを提供します。[ 16 ]

TRFPは励起後に光を発し、その寿命は時間相関単一光子計数法によって測定されます。mTFP1（青緑色、約2.6ナノ秒）やmScarlet-I（赤色、約3.1ナノ秒）などの変異体は、高い量子収率と光安定性を誇り、生細胞イメージングに適しています。遺伝子組み換えされたTRFPはプラスミドを介して細胞に導入され、タンパク質の折り畳み、イオンシグナル伝達、酵素活性などの非侵襲的なイベント追跡を可能にします。[ 16 ]

AI最適化されたTRFPは、寿命の延長と高輝度発光を特徴とし、超解像顕微鏡の進歩に貢献します。TRFPは、例えばショウジョウバエやゼブラフィッシュなどのモデル生物に用いられています。課題としては、光退色のリスク、複雑なFLIM機器、散乱による深部組織への浸透の制限などが挙げられます。赤方偏移バリアントは、これらの課題を解決する可能性があります。[ 16 ]

他の研究では、標的遺伝子研究のためにTRFPとCRISPRを組み合わせる試みがなされている。 [ 16 ]

腫瘍微小環境の検出といった臨床診断への統合には、費用対効果の高いFLIMが必要です。現在進行中の研究では、輝度の向上、毒性の低減、スペクトル範囲の拡大を目指しています。[ 16 ]

2025年、研究者らは28個の新規TRFPを作成し、色と時間間隔を追加することで、この技術の利用可能性を大幅に拡大しました。彼らはいくつかのアミノ酸残基を変異させることで、蛍光シグナルを生成する領域を不安定化させました。[ 17 ]

アプリケーション

蛍光分光法は、生化学、医学、化学研究分野などにおいて、有機化合物の分析に用いられています。また、悪性皮膚腫瘍と良性皮膚腫瘍の鑑別にも用いられたという報告もあります。

原子蛍光分光法 (AFS) 技術は、水銀などの重金属の検出に使用される CVAFSなど、空気や水、またはその他の媒体に存在する化合物の他の種類の分析/測定に役立ちます。

蛍光は光子の方向を変えるためにも使用できます。蛍光ソーラーコレクターを参照してください。

さらに、蛍光分光法は、マイクロ蛍光測定法を用いて顕微鏡レベルに適応させることができる。

分析化学では、蛍光検出器はHPLCで使用されます。

水研究の分野では、蛍光分光法は有機汚染物質を検出することで水質を監視するために使用することができます。[ 18 ]最近のコンピュータサイエンスと機械学習の進歩により、水の細菌汚染の検出も可能になりました。[ 19 ]

生物医学研究では、蛍光分光法は、蛍光剤を様々な薬剤に架橋させることにより、薬剤分布の効率を評価するために使用されています。[ 20 ]

生物物理学的研究における蛍光分光法は、細胞膜内の脂質ドメインを可視化し、特徴づけることを可能にする。[ 21 ]

TFRP は、分子の近接性を研究し、がんや神経変性疾患などの疾患における代謝変化を監視するフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)に使用されます。

参照

参考文献

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