タンパク質の折り畳み
折り畳み前と折り畳み後のタンパク質
タンパク質の折り畳みの結果

タンパク質のフォールディングとは、リボソームによってアミノ酸の直鎖として合成されたタンパク質が、不安定なランダムコイルからより秩序だった三次元構造へと変化する物理的プロセスである。この構造により、タンパク質は生物学的に機能的、あるいは活性的となる。[ 1 ]

多くのタンパク質のフォールディングは、ポリペプチド鎖の翻訳中にすでに始まっています。アミノ酸は互いに相互作用し、タンパク質の天然状態として知られる明確な三次元構造を形成します。この構造は、アミノ酸配列または一次構造によって決定されます。[ 2 ]

機能を果たすには正しい三次元構造が不可欠ですが、機能性タンパク質の一部は折り畳まれていないまま残る場合があり、[ 3 ]タンパク質のダイナミクスが重要であることを示しています。本来の構造に折り畳まれない場合、通常は不活性なタンパク質が生成されますが、誤って折り畳まれたタンパク質は機能性が変化したり、毒性を持つ場合があります。いくつかの神経変性疾患やその他の疾患は、誤って折り畳まれたタンパク質によって形成されたアミロイド線維の蓄積に起因すると考えられており、その感染性の変種はプリオンとして知られています。[ 4 ]多くのアレルギーは、免疫系が特定のタンパク質構造に対する抗体を生成しないため、一部のタンパク質の誤った折り畳みによって引き起こされます。[ 5 ]

タンパク質の変性は、折り畳まれた状態から折り畳まれていない状態へと遷移するプロセスです。これは、調理、火傷、タンパク質障害など様々な状況で起こります。折り畳まれていない状態とされるタンパク質に残留構造が存在する場合、それが折り畳みの開始部位となり、その後の折り畳み反応を誘導する可能性があります。[ 6 ]

折り畳み過程の持続時間は、対象となるタンパク質によって大きく異なります。細胞外で研究した場合、最も折り畳みの遅いタンパク質は、主にプロリン異性化のために、折り畳むのに数分から数時間かかり、プロセスが完了するまでにチェックポイントなどの多くの中間状態を通過する必要があります。[ 7 ]一方、最大100個のアミノ酸からなる非常に小さな単一ドメインタンパク質は、通常、1つのステップで折り畳まれます。 [ 8 ]ミリ秒単位の時間スケールが標準であり、最も速い既知のタンパク質折り畳み反応は数マイクロ秒以内に完了します。[ 9 ]タンパク質の折り畳み時間スケールは、そのサイズ、接触順序、および回路トポロジーによって異なります。[ 10 ]

タンパク質の折り畳みプロセスを理解し、シミュレートすることは、1960 年代後半以来、 計算生物学にとって重要な課題となっています。

タンパク質の折り畳みのプロセス

一次構造

タンパク質の一次構造、すなわち線状アミノ酸配列が、その本来の立体構造を決定します。[ 11 ]特定のアミノ酸残基とポリペプチド鎖中におけるその位置が、タンパク質のどの部分が密接に折り畳まれて三次元立体構造を形成するかを決定する要因となります。アミノ酸組成よりも配列が重要です。[ 12 ]しかし、折り畳みの本質的な事実は、各タンパク質のアミノ酸配列に、本来の構造とその状態を達成するための経路の両方を指定する情報が含まれているということです。これは、ほぼ同一のアミノ酸配列が常に同じように折り畳まれるということではありません。[ 13 ]立体構造は環境要因によっても異なり、類似のタンパク質でも、その存在場所によって折り畳み方が異なります。

二次構造

アルファヘリックスの螺旋構造
バックボーン内に水素結合を示す反平行βプリーツシート

二次構造の形成は、タンパク質が本来の構造をとるための折り畳み過程における最初のステップである。二次構造の特徴は、アルファヘリックスおよびベータシートとして知られる構造であり、これらは分子内水素結合によって安定化されているため、急速に折り畳まれる。これはライナス・ポーリングによって初めて特徴付けられた。分子内水素結合の形成は、タンパク質の安定性に対するもう1つの重要な貢献を提供する。[ 14 ] αヘリックスは、バックボーンの水素結合によってらせん形状を形成することによって形成される（右の図を参照）。[ 12 ] βプリーツシートは、バックボーンがそれ自体に屈曲して水素結合を形成する構造である（左の図に示すように）。水素結合は、ペプチド結合のアミド水素とカルボニル酸素の間にある。反平行βプリーツシートと平行βプリーツシートが存在し、反平行βシートでは理想的な180度の角度で水素結合するため、平行シートによって形成される傾斜した水素結合と比較して、水素結合の安定性が強くなります。[ 12 ]

三次構造

αヘリックスとβシートは一般的に両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を有する。この性質は、タンパク質の三次構造の形成に役立ち、親水性側がタンパク質を取り囲む水性環境に面し、疎水性側がタンパク質の疎水性コアに面するように折り畳まれる。[ 15 ]二次構造は階層的に三次構造形成へと移行する。タンパク質の三次構造が形成され、疎水性相互作用によって安定化されると、2つのシステイン残基間にジスルフィド結合が形成される形で共有結合が形成されることもある。これらの非共有結合および共有結合による接触は、タンパク質の本来の構造において特定の位相配置をとる。タンパク質の三次構造は単一のポリペプチド鎖を含むが、折り畳まれたポリペプチド鎖のさらなる相互作用によって四次構造が形成される。[ 16 ]

四次構造

一部のタンパク質では、三次構造が四次構造の形成につながることがあり、これは通常、すでに折り畳まれたサブユニットの「組み立て」または「共組み立て」を伴います。言い換えれば、複数のポリペプチド鎖が相互作用して、完全に機能する四次タンパク質を形成する可能性があります。[ 12 ]

タンパク質フォールディングの原動力

タンパク質構造のあらゆる形態を要約

フォールディングは、主に疎水性相互作用、分子内水素結合の形成、ファンデルワールス力によって導かれる自発的なプロセスであり、コンフォメーションエントロピーによって阻害される。[ 17 ]単離タンパク質のフォールディングの時間スケールは、そのサイズ、接触順序、回路トポロジーに依存する。細胞内では、フォールディングのプロセスは翻訳と共翻訳的に始まることが多く、タンパク質のN末端がフォールディングされ始める一方で、タンパク質のC末端部分はリボソームによってまだ合成されている。しかし、タンパク質分子は生合成中または生合成後に自発的にフォールディングすることもある。[ 18 ]これらの高分子は「自らフォールディングする」とみなされることもあるが、そのプロセスは溶媒（水または脂質二重層）、[ 19 ]塩の濃度、pH、温度、補因子および分子シャペロンの存在の可能性にも依存する。

タンパク質は、可能な屈曲角度や立体配座の制限により、折り畳み能力に限界があります。タンパク質の折り畳みにおけるこれらの許容角度は、許容回転角のψとφで表されるラマチャンドランプロットと呼ばれる2次元プロットで表されます。[ 20 ]

疎水効果

疎水性の崩壊。コンパクトな折り畳み構造（右側）では、疎水性アミノ酸（黒い球体で表示）が中心に向かって崩壊し、水性環境から保護されます。

タンパク質の折り畳みが細胞内で自発的に起こるためには、熱力学的に好ましい条件でなければなりません。タンパク質の折り畳みは自発的な反応であることが知られているため、負のギブス自由エネルギー値をとることになります。タンパク質の折り畳みにおけるギブス自由エネルギーは、エンタルピーとエントロピーに直接関係しています。[ 12 ]負のデルタGが生じ、タンパク質の折り畳みが熱力学的に好ましい条件で起こるためには、エンタルピー、エントロピー、またはその両方が熱力学的に好ましい条件でなければなりません。

疎水性溶質の近くでは水分子がより整列するにつれてエントロピーは減少します。

水にさらされる疎水性側鎖の数を最小限に抑えることは、折り畳みプロセスの重要な原動力です。[ 21 ]疎水効果は、タンパク質の疎水性鎖がタンパク質の中心部（親水性環境から離れて）に崩壊する現象です。[ 12 ]水性環境では、水分子はタンパク質の疎水性領域または側鎖の周りに集まる傾向があり、秩序だった水分子の水殻を作り出します。[ 22 ]疎水性領域の周りの水分子の秩序化は、システム内の秩序を増大させ、したがってエントロピーの負の変化（システム内のエントロピーの減少）に寄与します。水分子はこれらの水ケージに固定され、疎水性崩壊、または疎水性基の内側への折り畳みを促進します。疎水性崩壊は、水ケージの破壊を介してシステムにエントロピーを戻し、秩序だった水分子を解放します。[ 12 ]球状タンパク質のコア内部で相互作用する多数の疎水基は、蓄積されたファンデルワールス力（特にロンドン分散力）のために、フォールディング後のタンパク質の安定性に大きく寄与する。[ 12 ]疎水効果は、大きな疎水領域を含む両親媒性分子を含む水性媒体が存在する場合にのみ、熱力学における駆動力として存在する。[ 23 ]水素結合の強さはその環境に依存するため、疎水性コアに包まれた水素結合は、水性環境にさらされた水素結合よりも、天然状態の安定性に大きく寄与する。[ 24 ]

球状フォールドを持つタンパク質では、疎水性アミノ酸はランダムに分布したりクラスター化したりするのではなく、一次配列に沿って点在する傾向があります。[ 25 ] [ 26 ]しかし、最近新たに生まれたタンパク質は本質的に無秩序である傾向があり、[ 27 ] [ 28 ]一次配列に沿って疎水性アミノ酸がクラスター化するという逆のパターンを示します。[ 29 ]

付き添い人

小さな真核生物の熱ショックタンパク質の例

分子シャペロンは、生体内で他のタンパク質が正しく折り畳まれるのを助けるタンパク質の一種である。シャペロンはすべての細胞区画に存在し、ポリペプチド鎖と相互作用してタンパク質の本来の3次元構造を形成できるようにするが、シャペロン自体は、それが支援しているタンパク質の最終構造には含まれない。[ 30 ]シャペロンは、新生ポリペプチドがリボソームによって合成されているときでも、折り畳みを支援する場合がある。[ 31 ]分子シャペロンは、折り畳み経路にあるタンパク質の不安定な構造を安定化するために結合することによって機能するが、シャペロンには、支援しているタンパク質の正しい本来の構造を知るために必要な情報は含まれていない。むしろ、シャペロンは誤った折り畳み構造を防ぐことで機能する。[ 31 ]このように、シャペロンは実際には、本来の構造に向かう折り畳み経路に関係する個々のステップの速度を上げているわけではない。シャペロンは、適切な中間体の探索を遅らせる可能性のあるポリペプチド鎖の不要な凝集を減らすことによって機能し、ポリペプチド鎖が正しい構造をとるためのより効率的な経路を提供します。[ 30 ]シャペロンは、フォールディング経路の遅いステップに関与する化学反応を触媒するフォールディング触媒タンパク質と混同しないでください。フォールディング触媒の例には、ジスルフィド結合の形成やペプチドグループのシスとトランスの立体異性体間の相互変換に関与している可能性のあるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとペプチジルプロリルイソメラーゼがあります。[ 31 ]シャペロンは、タンパク質が適切なアラインメントと構造をとるのに必要な支援をタンパク質に提供し、「生物学的に関連性がある」ようになるのに十分効率的であるため、生体内でのタンパク質フォールディングプロセスに不可欠であることが示されている。 [ 32 ]これは、 in vitroで行われたタンパク質フォールディング実験によって実証されているように、ポリペプチド鎖は理論的にはシャペロンの支援なしに本来の構造に折り畳まれる可能性があることを意味します。[ 32 ]しかし、このプロセスは生物系で存在するには効率が悪すぎるか遅すぎることが証明されているため、生体内でのタンパク質フォールディングにはシャペロンが不可欠です。シャペロンは、天然構造の形成を助ける役割に加えて、タンパク質の輸送、分解、さらには変性タンパク質の分解など、様々な役割に関与していることが示されています。特定の外部変性因子にさらされると、正しい天然構造に再折り畳みされる機会が得られる。[ 33 ]

完全に変性したタンパク質は三次構造と二次構造の両方を欠き、いわゆるランダムコイルとして存在する。特定の条件下では、一部のタンパク質はリフォールディングできるが、多くの場合、変性は不可逆である。[ 34 ]細胞は、熱ショックタンパク質（シャペロンの一種） と呼ばれる酵素を使用して、熱による変性の影響からタンパク質を保護することがある。この酵素は、他のタンパク質のフォールディングとフォールディング状態の維持の両方を助ける。熱ショックタンパク質は、細菌からヒトまで、調査されたすべての種で見つかっており、これは、熱ショックタンパク質が非常に初期に進化し、重要な機能を持っていることを示唆している。一部のタンパク質は、シャペロンの助けを借りなければ細胞内でまったくフォールディングされない。シャペロンは、個々のタンパク質を隔離してフォールディングが他のタンパク質との相互作用によって中断されないようにするか、誤ってフォールディングされたタンパク質をほどいて、正しい天然構造にリフォールディングできるようにする。[ 35 ]この機能は、不溶性のアモルファス凝集体への沈殿のリスクを防ぐために重要である。タンパク質の変性や本来の状態の破壊に関与する外的要因には、温度、外部場（電場、磁場）[ 36 ] 、分子の密集[ 37 ]、さらには空間の制限（閉じ込め）などがあり、これらはタンパク質の折り畳みに大きな影響を与える可能性があります。[ 38 ]溶質の高濃度、極端なpH、機械的力、化学変性剤の存在もタンパク質の変性に寄与する可能性があります。これらの個々の要因はまとめてストレスとして分類されます。シャペロンは細胞ストレス時に濃度が増加し、変性したタンパク質や誤って折り畳まれたタンパク質だけでなく、新しく出現したタンパク質の適切な折り畳みを助けることが示されています。[ 30 ]

特定の条件下では、タンパク質は生化学的に機能的な形態に折り畳まれないことがあります。細胞が生存する温度範囲を超える、または下回る温度では、熱的に不安定なタンパク質は変性または変性します（これが、卵白が沸騰すると白濁する理由です）。しかし、タンパク質の熱安定性は一定ではありません。例えば、122℃という高温で増殖する超好熱細菌が発見されています[ 39 ]。当然のことながら、その細菌の必須タンパク質とタンパク質集合体全体が、その温度以上で安定している必要があります。

大腸菌はバクテリオファージT4の宿主であり、ファージがコードするgp31タンパク質（P17313 ）は、大腸菌シャペロンタンパク質GroESと構造的にも機能的にも相同性があり、感染時にバクテリオファージT4ウイルス粒子の組み立てにおいてGroESの代わりを務めることができると考えられている。[ 40 ] GroESと同様に、gp31はGroELシャペロンと安定した複合体を形成し、これはバクテリオファージT4の主要カプシドタンパク質gp23の生体内での折り畳みと組み立てに不可欠である。[ 40 ]

フォールドスイッチング

一部のタンパク質は複数の天然構造を持ち、何らかの外的要因に応じてフォールドを変化させます。例えば、KaiBタンパク質は1日を通してフォールドを変化させ、シアノバクテリアの時計として機能します。PDB（タンパク質データバンク）に登録されているタンパク質の約0.5～4%がフォールドを変化させると推定されています。[ 41 ]

タンパク質のミスフォールディングと神経変性疾患

タンパク質が正常な天然状態に戻れない場合、ミスフォールドしていると考えられます。これは、アミノ酸配列の変異、または外部要因による正常なフォールディングプロセスの破壊が原因である可能性があります。[ 42 ]ミスフォールドしたタンパク質には通常、クロスβ構造として知られる超分子配列に組織化されたβシートが含まれます。これらのβシートを多く含むアセンブリは非常に安定しており、非常に不溶性で、一般的にタンパク質分解に抵抗性です。 [ 43 ]これらの線維状アセンブリの構造的安定性は、βストランド間のバックボーン水素結合によって形成されたタンパク質モノマー間の広範な相互作用によって引き起こされます。[ 43 ]タンパク質のミスフォールドは、他のタンパク質のさらなるミスフォールドと凝集体またはオリゴマーへの蓄積を引き起こす可能性があります。細胞内の凝集タンパク質のレベルが増加すると、アミロイド様構造の形成につながり、変性疾患や細胞死を引き起こす可能性があります。[ 42 ]アミロイドは、分子間水素結合を含む線維状構造であり、非常に不溶性であり、変性したタンパク質凝集体から構成されています。[ 42 ]そのため、プロテアソーム経路は、ミスフォールドしたタンパク質を凝集前に分解するのに十分な効率がない可能性があります。ミスフォールドしたタンパク質は互いに相互作用し、構造化された凝集体を形成し、分子間相互作用を通じて毒性を獲得する可能性があります。[ 42 ]

凝集したタンパク質は、クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症（狂牛病）などのプリオン関連疾患、アルツハイマー病や家族性アミロイド心筋症または多発性ニューロパチーなどのアミロイド関連疾患、[ 44 ]およびハンチントン病やパーキンソン病などの細胞内凝集疾患と関連している。[ 4 ] [ 45 ]これらの加齢性変性疾患は、誤って折り畳まれたタンパク質が不溶性の細胞外凝集体および/またはクロスβアミロイド線維などの細胞内封入体に凝集することに関連している。凝集体が原因であるのか、それともタンパク質の恒常性（合成、折り畳み、凝集、タンパク質のターンオーバーのバランス）の喪失を反映しているに過ぎないのかは完全には明らかではない。最近、欧州医薬品庁は、トランスサイレチンアミロイド疾患の治療にタファミディスまたはビンダケル（四量体トランスサイレチンの運動安定剤）の使用を承認しました。これは、アミロイド線維形成のプロセス（線維自体ではなく）がヒトアミロイド疾患における有糸分裂後組織の変性を引き起こすことを示唆しています。 [ 46 ]折り畳みと機能の代わりに誤った折り畳みと過剰な分解が、機能喪失が疾患の原因であるアンチトリプシン関連肺気腫、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積症などの多くのタンパク質異常症を引き起こします。歴史的にタンパク質補充療法は後者の疾患を治療するために使用されてきましたが、医薬品シャペロンを使用して変異タンパク質を折り畳んで機能させるという 新たなアプローチがあります。

タンパク質の折り畳みを研究するための実験技術

タンパク質の折り畳みに関する推論は突然変異研究を通じて行うことができますが、通常、タンパク質の折り畳みを研究するための実験技術は、タンパク質の段階的な展開または折り畳みと、標準的な非結晶学的技術を使用した構造変化の観察に依存しています。

X線結晶構造解析

X線結晶構造解析の手順

X 線結晶構造解析は、折り畳まれたタンパク質の 3 次元構造を解読するための、より効率的で重要な方法の 1 つです。[ 47 ] X 線結晶構造解析を行うには、調査対象のタンパク質が結晶格子内に配置されている必要があります。タンパク質を結晶格子内に配置するには、結晶化に適した溶媒を用意し、溶液中で過飽和レベルの純粋なタンパク質を得て、結晶を溶液中で沈殿させる必要があります。[ 48 ]タンパク質が結晶化されると、X 線ビームを結晶格子に集中させることができ、ビームは回折するか、さまざまな方向に外側に発射されます。これらの出て行くビームは、その中に含まれるタンパク質の特定の 3 次元構造と相関しています。X 線は、タンパク質結晶格子内の個々の原子を取り囲む電子雲と特異的に相互作用し、識別可能な回折パターンを生成します。[ 15 ]電子密度雲とX線の振幅を関連付けることによってのみ、このパターンを読み取り、この方法を複雑にする位相または位相角の仮定につながる。[ 49 ]フーリエ変換として知られる数学的基礎によって確立された関係がなければ、「位相問題」によって回折パターンの予測は非常に困難になる。[ 15 ]多重同形置換法などの新しい方法では、重金属イオンの存在を利用してX線をより予測可能な方法で回折させ、関連する変数の数を減らし、位相の問題を解決している。[ 47 ]

蛍光分光法

蛍光分光法は、タンパク質の折り畳み状態を研究するための高感度な手法です。フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）の3つのアミノ酸は固有の蛍光特性を有しますが、量子収率が高く良好な蛍光シグナルが得られることから、実験的にはTyrとTrpのみが用いられます。TrpとTyrはどちらも280 nmの波長で励起されますが、295 nmの波長ではTrpのみが励起されます。TrpとTyr残基は芳香族性を持つため、タンパク質の疎水性コア、2つのタンパク質ドメイン間の界面、またはオリゴマータンパク質のサブユニット間の界面に、完全にまたは部分的に埋もれていることがよくあります。このような非極性環境下では、これらの残基は高い量子収率を示し、したがって高い蛍光強度を示します。タンパク質の三次構造または四次構造が破壊されると、これらの側鎖は溶媒の親水性環境にさらしやすくなり、量子収率が低下して蛍光強度が低下します。 Trp 残基の場合、最大蛍光発光の波長も環境に依存します。

蛍光分光法は、蛍光発光の強度または最大発光波長の変化を変性剤の値の関数として測定することにより、タンパク質の平衡アンフォールディングを特徴付けるために使用できます。 [ 50 ] [ 51 ]変性剤としては、化学分子（尿素、グアニジン塩酸塩）、温度、pH、圧力などがあります。異なるが離散的なタンパク質状態、つまり天然状態、中間状態、アンフォールディング状態間の平衡は、変性剤の値に依存します。したがって、それらの平衡混合物の全体的な蛍光信号もこの値に依存します。したがって、全体的なタンパク質信号と変性剤の値とを関連付けるプロファイルが得られます。平衡アンフォールディングのプロファイルにより、アンフォールディングの中間体を検出および識別できるようになります。[ 52 ] [ 53 ]ユーグ・ベドゥエルは、このようなプロファイルから、ホモマーまたはヘテロマーのタンパク質から三量体、場合によっては四量体までの展開平衡を特徴付ける熱力学的パラメータを得るための一般的な方程式を開発しました。[ 50 ]蛍光分光法は、ストップトフローなどの高速混合装置と組み合わせて、タンパク質の折り畳み速度を測定し、[ 54 ]シェブロンプロットを生成し、ファイ値分析を導出することができます。

円二色性

円二色性は、タンパク質の折り畳みを研究するための最も一般的で基本的なツールの 1 つです。円二色性分光法は、円偏光の吸収を測定します。タンパク質では、 α ヘリックスやβ シートなどの構造がキラルであるため、このような光を吸収します。この光の吸収は、タンパク質集団の折り畳みの程度のマーカーとして機能します。この技術は、この吸収の変化を変性剤の濃度または温度の関数として測定することにより、タンパク質の平衡アンフォールディングを測定するために使用されています。変性剤融解は、タンパク質の m 値、つまり変性剤依存性だけでなく、アンフォールディングの自由エネルギーも測定します。温度融解は、タンパク質の変性温度(Tm) を測定します[ 50 ] 。蛍光分光法と同様に、円二色性分光法は、ストップトフローなどの高速混合装置と組み合わせて、タンパク質の折り畳み速度を測定し、シェブロン プロットを生成することができます。

タンパク質の振動円二色性

タンパク質の振動円二色性（VCD）法の最近の発展は、現在ではフーリエ変換（FT）装置も利用しており、非常に大きなタンパク質分子であっても、溶液中のタンパク質の立体配座を決定する強力な手段となっています。このようなタンパク質のVCD研究は、タンパク質結晶のX線回折データ、重水（D 2 O）中のタンパク質溶液のFT-IRデータ、あるいは量子計算と組み合わせることができます。

タンパク質核磁気共鳴分光法

タンパク質核磁気共鳴（NMR）は、濃縮タンパク質サンプルに磁場を誘導することで、タンパク質の構造データを収集することができる。NMRでは、化学的環境に依存して、特定の核が特定の無線周波数を吸収する。[ 55 ] [ 56 ]タンパク質の構造変化はナノ秒からミリ秒の時間スケールで作用するため、NMRは特にピコ秒から秒の時間スケールで中間構造を調べるのに適している。[ 57 ]タンパク質構造と非フォールディングタンパク質構造変化を調べる主な技術には、COSY、TOCSY、  HSQC、時間緩和（T1とT2）、NOEなどがある。[ 55 ] NOEは、空間的に近い水素間の磁化移動を観察できるため、特に有用である。[ 55 ]異なるNMR実験は、異なるタンパク質構造変化に適したさまざまな程度の時間スケール感度を有する。 NOEは結合振動や側鎖回転を捉えることができるが、タンパク質の折り畳みはより大きな時間スケールで起こるため、NOEはそれを捉えるには敏感すぎる。[ 57 ]

NMR実験と一致するタンパク質構造変化のタイムスケール。タンパク質フォールディングについては、CPMG緩和分散法（CPMG RD）と化学交換飽和移動法（CEST）により適切なタイムスケールでデータを収集します。

タンパク質の折り畳みはおよそ 50～3000 s −1で起こるため、CPMG 緩和分散と化学交換飽和移動は、折り畳みの NMR 分析における主要な技術のいくつかになっています。[ 56 ]さらに、両方の技術は、タンパク質折り畳みランドスケープ内の励起中間状態を明らかにするために使用されます。[ 58 ]これを行うために、CPMG 緩和分散は、スピンエコー現象を利用します。この技術は、標的の核を 90 パルスに続いて 180 パルスにさらします。[ 59 ]核が再フォーカスすると、広い分布は、標的の核が中間励起状態に関与していることを示します。緩和分散プロットを見ると、データは励起状態と基底状態の間の熱力学と速度論に関する情報を集めます。[ 59 ] [ 58 ]飽和移動は、励起状態が摂動したときに基底状態からの信号が変化するのを測定します。弱い無線周波数照射を用いて特定の原子核の励起状態を飽和させ、その飽和状態を基底状態に移行する。[ 56 ]この信号は基底状態の磁化（および信号）を減少させることによって増幅される。[ 56 ] [ 58 ]

NMRの主な限界は、25 kDaを超えるタンパク質では解像度が低下し、X線結晶構造解析ほど詳細ではないことです。[ 56 ]さらに、タンパク質NMR分析は非常に難しく、同じNMRスペクトルから複数の解が提案されることがあります。[ 55 ]

筋萎縮性側索硬化症に関与するタンパク質SOD1のフォールディングに焦点を当てた研究では、緩和分散と飽和移動を用いて励起中間体が研究されました。[ 60 ] SOD1はこれまで、タンパク質凝集に関与すると考えられていた多くの疾患原因変異体と関連付けられていましたが、そのメカニズムは未だ解明されていませんでした。緩和分散と飽和移動の実験を用いることで、SOD1変異体において多くの励起中間体状態がミスフォールディングされていることが明らかになりました。[ 60 ]

二重偏光干渉計

二重偏光干渉法は、分子層の光学特性を測定する表面ベースの技術です。タンパク質のフォールディング特性を評価するために用いられる場合、タンパク質単層の全体サイズと密度をサブオングストローム分解能でリアルタイムに測定することで、立体構造を測定します。 [ 61 ]ただし、タンパク質フォールディングの速度論的リアルタイム測定は、約10 Hz未満の速度で起こるプロセスに限定されます。円偏光二色性と同様に、フォールディングの刺激は変性剤または温度です。

高解像度での折り畳みの研究

タンパク質フォールディングの研究は、近年、高速時間分解技術の開発によって大きく進歩しました。実験者は、未フォールディングタンパク質サンプルのフォールディングを迅速に誘発し、その結果生じるダイナミクスを観察します。現在使用されている高速技術には、溶液の超高速混合、光化学的方法、レーザー温度ジャンプ分光法などがあります。これらの技術の開発に貢献した多くの科学者の中には、ハインリッヒ・ローダー、テリー・オース、ハリー・グレイ、マーティン・グルベール、ブライアン・ダイアー、ウィリアム・イートン、シーナ・ラドフォード、クリス・ドブソン、アラン・ファーシュト、ベングト・ノルティング、ラース・コナーマンなどがいます。

タンパク質分解

タンパク質分解は、広範囲の溶液条件下で折り畳まれていない画分を調べるために日常的に使用されています（例：高速並列タンパク質分解（FASTpp））。[ 62 ] [ 63 ]

単分子力分光法

光ピンセットや AFM などの単一分子技術は、シャペロンを持つタンパク質だけでなく、単離されたタンパク質のタンパク質フォールディング機構を理解するために使用されてきた。[ 64 ]光ピンセットは、単一のタンパク質分子をその C 末端と N 末端から引き伸ばし、それらを折り畳んで展開し、その後の再折り畳みを研究するために使用されている。[ 65 ]この技術により、単一分子レベルでの折り畳み速度を測定できる。例えば、光ピンセットは最近、血液凝固に関与するタンパク質の折り畳みと展開の研究に使用されている。フォン ヴィレブランド因子(vWF) は、血栓形成プロセスに重要な役割を果たすタンパク質である。単一分子光ピンセット測定を使用して、カルシウムに結合した vWF が血液中でせん断力センサーとして機能することが発見された。せん断力は vWF の A2 ドメインの展開につながり、その再折り畳み速度はカルシウムの存在下で劇的に増加する。[ 66 ]最近、単純なsrc SH3ドメインが力を受けて複数の展開経路にアクセスすることも示された。[ 67 ]

ビオチン塗装

ビオチンペインティングは、折り畳まれた（または折り畳まれていない）タンパク質の状態特異的な細胞スナップショットを可能にします。ビオチン「ペインティング」は、予測される本質的に無秩序なタンパク質への偏りを示します。[ 68 ]

タンパク質の折り畳みに関する計算論的研究

タンパク質フォールディングの計算研究には、タンパク質の安定性、運動学、構造の予測に関連する3つの主要な側面が含まれます。2013年のレビューでは、タンパク質フォールディングに利用可能な計算手法がまとめられています。 [ 69 ]

レヴィンタールのパラドックス

1969 年、サイラス レビンサルは、折り畳まれていないポリペプチド鎖の自由度が非常に大きいため、分子には天文学的な数の立体配座の可能性があると指摘しました。彼の論文の 1 つでは、3,300または10,143という推定が行われました。 [ 70 ]レビンサルのパラドックスは、タンパク質がすべての可能な立体配座を順次サンプリングすることによって折り畳まれると、立体配座が高速 (ナノ秒またはピコ秒スケール) でサンプリングされたとしても、折り畳まれるには天文学的な時間がかかるという観察に基づく思考実験です。[ 71 ]タンパク質がこれよりはるかに速く折り畳まれるという観察に基づいて、レビンサルは、ランダムな立体配座の探索は行われず、したがってタンパク質は一連の準安定中間状態を経て折り畳まれるに違いないと提案しました。

タンパク質フォールディングのエネルギーランドスケープ

折り畳まれていないポリペプチド鎖が本来の構造をとるエネルギーの漏斗

タンパク質の折り畳み過程における配置空間は、エネルギーランドスケープとして視覚化できる。ジョセフ・ブリンゲルソンとピーター・ウォリンズによれば、タンパク質は最小フラストレーションの原理に従う。これは、自然に進化したタンパク質が折り畳みエネルギーランドスケープを最適化し、[ 72 ]自然はタンパク質の折り畳み状態が十分に安定するようにアミノ酸配列を選択したことを意味する。さらに、折り畳み状態の獲得は十分に高速なプロセスになる必要があった。自然はタンパク質のフラストレーションのレベルを低減してきたが、タンパク質のエネルギーランドスケープにおける局所的最小値の存在からわかるように、ある程度のフラストレーションは現在でも残っている。

これらの進化的に選択された配列の結果として、タンパク質は一般的に、主に天然状態へと向かう、全体的に「漏斗状のエネルギーランドスケープ」（ José Onuchicによる造語）[ 73 ]を持つと考えられています。この「フォールディング・ファンネル」ランドスケープは、タンパク質が単一のメカニズムに限定されるのではなく、多数の経路や中間体のいずれかを経由して天然状態にフォールディングすることを可能にします。この理論は、モデルタンパク質の計算シミュレーションと実験研究の両方によって裏付けられており[ 72 ] 、タンパク質構造の予測と設計手法の改善に用いられてきました。[ 72 ]タンパク質のフォールディングを平準化自由エネルギーランドスケープで記述することは、熱力学第二法則とも整合しています。[ 74 ]物理的には、ランドスケープを、最大値、鞍点、最小値、漏斗といった単純な視覚化可能なポテンシャル面または全エネルギー面、つまり地理的ランドスケープとして考えることは、おそらく少し誤解を招くでしょう。関連する記述は実際には、多様体が様々なより複雑な位相的形態をとる可能性がある高次元位相空間である。[ 75 ]

折り畳まれていないポリペプチド鎖は、漏斗の頂点から始まり、そこでは最も多くの折り畳まれていないバリエーションを取り得る可能性があり、エネルギー状態は最も高い。このようなエネルギーランドスケープは、初期の可能性は多数存在するものの、天然状態は1つしかあり得ないことを示している。しかし、これは、起こり得る折り畳み経路が多数あることを示しているわけではない。全く同じタンパク質の異なる分子は、同じ天然構造に到達する限り、わずかに異なる折り畳み経路をたどり、異なる低エネルギー中間体を求める可能性がある。[ 76 ]異なる経路は、各経路の熱力学的有利性に応じて、異なる利用頻度を持つ可能性がある。これは、ある経路が他の経路よりも熱力学的に有利であることが判明した場合、天然構造の追求においてその経路がより頻繁に使用される可能性が高いことを意味する。[ 76 ]タンパク質が折り畳まれ、様々な立体構造を取り始めると、常に以前よりも熱力学的に有利な構造を求め、エネルギー漏斗を通過し続ける。二次構造の形成はタンパク質の安定性の向上を強く示唆しており、ポリペプチド骨格が想定する二次構造の1つの組み合わせのみが最低エネルギーを持ち、したがってタンパク質の天然状態で存在する。[ 76 ]ポリペプチドが折り畳まれ始めると最初に形成される構造の中にはαヘリックスとβターンがあり、αヘリックスはわずか100ナノ秒で、βターンは1マイクロ秒で形成されることがある。[ 30 ]

エネルギーファネル図には、特定のタンパク質の遷移状態が見られる鞍点が存在する。 [ 30 ]エネルギーファネル図における遷移状態とは、タンパク質が最終的に天然構造をとるために、そのタンパク質のすべての分子がとらなければならない立体配座である。遷移状態を経ずに天然構造をとるタンパク質は存在しない。[ 30 ]遷移状態は、単なる中間段階ではなく、天然状態の変種または未成熟形態と呼ぶことができる。[ 77 ]遷移状態のフォールディングは律速であることが示されており、天然フォールディングよりも高いエネルギー状態にあるにもかかわらず、天然構造と非常によく似ている。遷移状態内には、タンパク質がフォールディングできる核が存在する。これは「核形成凝縮」と呼ばれるプロセスによって形成され、構造が核に崩壊し始める。[ 77 ]

タンパク質フォールディングのモデリング

Folding@home は、ここで図示されているようなマルコフ状態モデルを使用して、タンパク質が初期のランダムコイル状態 (左) から本来の 3D 構造 (右) に凝縮されるときにとり得る形状と折り畳み経路をモデル化します。

計算によるタンパク質構造予測のためのde novoまたはab initio手法は、タンパク質フォールディングのさまざまな側面をシミュレートするために使用できます。分子動力学(MD) は、タンパク質のフォールディングとダイナミクスのin silicoシミュレーションに使用されました。 [ 78 ]最初の平衡フォールディングシミュレーションは、暗黙の溶媒モデルとアンブレラサンプリングを使用して行われました。 [ 79 ]計算コストのため、明示的な水を使用した ab initio MD フォールディングシミュレーションは、ペプチドと小さなタンパク質に限定されています。 [ 80 ] [ 81 ]より大きなタンパク質の MD シミュレーションは、実験構造のダイナミクスまたはその高温アンフォールディングに制限されています。 より大きなタンパク質 (>150 残基) のフォールディングのような長時間のフォールディングプロセス (約 1 ミリ秒を超える) には、粗視化モデルを使用してアクセスできます。 [ 82 ] [ 83 ] [ 84 ]

Rosetta@home [ 85 ] 、Folding@home [ 86 ]、Foldit [ 87 ]などのいくつかの大規模計算プロジェクトは、タンパク質の折り畳みをターゲットにしています。

DE Shaw ResearchがカスタムASICとインターコネクトを基盤として設計・構築した超並列スーパーコンピュータAntonを用いて、長距離連続軌道シミュレーションが行われた。2011年時点でAntonを用いたシミュレーションで発表された最長のシミュレーション結果は、355 KにおけるNTL9の2.936ミリ秒のシミュレーションであった。[ 88 ]このようなシミュレーションは現在、小さなタンパク質（150アミノ酸残基未満）を平衡状態で展開・再折り畳みし、変異が折り畳みの速度と安定性にどのように影響するかを予測することができる。[ 89 ]

2020年、DeepMindが開発した人工知能（AI）タンパク質構造予測プログラムであるAlphaFoldを使用した研究チームが、長年続いている構造予測コンテストCASPで1位を獲得しました。 [ 90 ]チームは他のどのグループよりもはるかに高い精度を達成しました。[ 91 ] CASPのグローバル距離テスト（GDT）では、約3分の2のタンパク質で90％以上のスコアを獲得しました。GDTは、計算プログラムによって予測された構造と、実験室で実験的に決定された経験的構造との類似度を測定するテストです。100点のスコアは、GDTの計算に使用される距離のカットオフ内で、完全に一致していると見なされます。[ 92 ]

CASPにおけるAlphaFoldのタンパク質構造予測結果は、「変革的」かつ「驚異的」と評された。[ 93 ] [ 94 ]一部の研究者は、その予測精度は予測の3分の1にも満たず、タンパク質折り畳みの問題を解決したと見なすにはタンパク質折り畳みの物理的メカニズムが明らかにされていないと指摘した。[ 95 ]それでも、これは計算生物学における重要な成果であり[ 92 ] 、タンパク質の構造予測という生物学の数十年にわたる大きな課題に向けた大きな進歩であると考えられている。[ 93 ]

参照

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