酵母が同化できる窒素
酵母は発酵を正常に完了するために、同化できる形態の信頼できる窒素源を必要とします。

酵母が同化できる窒素（YAN）は、遊離アミノ窒素（FAN）、アンモニア（NH 3）、アンモニウム（NH 4 +）の組み合わせで、ワイン酵母サッカロミセス・セレビシエなどが発酵中に利用できる。発酵可能な糖であるグルコースとフルクトース以外では、窒素は、発酵を成功させ、意図した乾燥点に達する前に発酵が終わらない、あるいは異臭やそれに関連するワインの欠陥が生じないために必要な最も重要な栄養素である。このため、ワインメーカーは利用可能なYAN資源を、リン酸二アンモニウム（DAP）などの窒素添加剤で補うことが多い。[ 1 ]

しかし、過剰な窒素添加は、有益なワイン酵母以外の微生物も栄養素を利用できるため、危険をもたらす可能性があります。これらの微生物には、ブレタノマイセス属、アセトバクター属、ラクトバチルス属およびペディオコッカス属の乳酸菌などの腐敗菌が含まれます。そのため、多くのワイナリーでは、収穫後および圧搾後に、分光計を用いたo-フタルジアルデヒド窒素定量法（NOPA法）やフォルモール滴定法など、現在利用可能ないくつかの方法を用いてYANを測定しています。マスト中のYANを知ることで、ワインメーカーは発酵に必要な添加剤の適切な量を計算することができ、後から発生する腐敗菌のために「栄養砂漠」のみを残すことができます。[ 2 ]

ワインメーカーがブドウの果汁中に見るYANの量は、ブドウの品種、台木、ブドウ園の土壌、ブドウ栽培方法（肥料の使用や樹冠管理など）、特定のヴィンテージの気候条件など、さまざまな要素によって異なります。[ 3 ]

コンポーネント

ブドウの YAN 含有量のほとんどは、圧搾後に搾りかすとして残る皮と種子に含まれています。

YANは、 S. cerevisiaeが同化できる主要な有機（遊離アミノ酸）および無機（アンモニアおよびアンモニウム）窒素源の測定値です。ブドウ果汁とワインには、ペプチド、巨大タンパク質、アミド、生体アミン、ピリジン、プリン、核酸など、いくつかの窒素化合物が含まれていますが、これらは酵母が代謝に直接使用することができません。まとめると、ブドウ果汁の窒素含有量は1リットルあたり60～2400 mgの範囲になりますが、この窒素のすべてが同化できるわけではありません。[ 1 ]大きなペプチドを細胞外で働くことができる小さな成分に分解するプロテアーゼ酵素がないため、酵母が窒素源として使用できる分子のサイズが制限されます。[ 3 ] [ 4 ]

ワインメーカーがブドウのマスト（果汁）中に検出するYANの量は、ブドウの品種、台木、畑の土壌、栽培方法（肥料の使用やキャノピー管理など）、そして特定のヴィンテージの気候条件など、多くの要素に依存します。ボトリティス・シネレア（望ましくは貴腐として知られる）などのカビの感染は、ブドウのマスト中のアミノ酸含有量を最大61%も減少させる可能性があります。[ 1 ]ワシントン州のようにYANが低い地域もあり、典型的なヴィンテージでは検査されたマストの90%が400 mg N/L未満[ 5 ]、ほぼ4分の1が150 mg N/L未満です。[ 2 ]

ブドウ園では、窒素はブドウの木に硝酸塩（NO 3 −）、アンモニウム、または尿素として吸収され、アンモニアに還元されます。その後の反応で窒素はグルタミンとグルタミン酸に取り込まれ、最終的には他のアミノ酸や窒素化合物の合成に利用されます。[ 1 ]収穫後、ブドウに含まれる窒素化合物の大部分（約80%）は果皮と種子に濃縮されます。これらの化合物は、破砕工程やマセレーション／スキンコンタクト中にマスト（果汁）に放出されます。[ 4 ]圧搾後も、ブドウの果実に含まれる窒素含有量の最大80%がポマス（果皮）に残ります。[ 3 ]

アミノ酸

YANを構成する遊離アミノ窒素（FAN）のうち、アルギニン、プロリン、グルタミンが最も多く、次いでアラニン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸が微量に含まれています[ 1 ]が、ブドウ果汁にはほとんどの既知のアミノ酸が微量に含まれています。[ 2 ]プロリンは通常最も濃縮されており、アミノ酸の総量の最大30％を占めることがあります。[ 4 ] FANの正確な量は変動し、遊離アミノ酸に由来するYAN1リットルあたり窒素22～1242mgの範囲になります。[ 5 ]

酵母細胞の細胞膜内にある特殊な輸送タンパク質(左端)は、アミノ酸残基と小さなペプチドを水素イオンと結合させて細胞内に運び、その後、細胞から排出されます。

アルギニン、グルタミン、その他のアミノ酸は発酵のごく初期に急速に消費されることが多いのに対し、プロリンは通常の嫌気性発酵条件下では酵母によって全く消費されません。これは、プロリンの利用に必要な酵素の1つが酸化酵素（分子状酸素を必要とする）であり、もう1つの酵素がマスト中のアンモニウム（酵母が必要とする別の同化性窒素源）の存在によって抑制されるためです。しかし、リン酸二アンモニウムを添加していないマストを含む、十分に空気を含んだスターターカルチャーでは、嫌気性発酵が始まる前にプロリンがいくらか利用されるのが一般的です。 [ 1 ]ワインメーカーがFANを測定する際、プロリンが含まれているかどうかを意識する必要があります。プロリンが含まれているとYANの測定値が高くなるためです。シャルドネとカベルネ・ソーヴィニヨンは、非常に高いプロリン含有量で知られるブドウ品種ですが、リースリングとソーヴィニヨン・ブランは通常、非常に低いプロリン含有量を示します。[ 4 ]

酵母は、特殊な膜タンパク質と、酸性ワイン溶液（pH 3～4）のpH勾配と酵母細胞内の細胞質のほぼ中性pHの差を利用した能動輸送プロセスを介して、アミノ酸と小さなペプチド（5アミノ酸残基未満）を細胞内に輸送します。膜内のプロトン共輸送タンパク質は、水素イオンと結合したアミノ酸を取り込み、その後、水素イオンポンプを介して細胞から排出されます。これはエネルギー依存的なプロセスであり、発酵が進みエタノール濃度が上昇するにつれて、酵母細胞にとってエネルギー的に不利な状況になり、過剰な水素イオンが細胞内に「受動的な漏出」を引き起こします。細胞の水素イオンポンプは、細胞内のpHを維持するためにより多くの働きをしなければならないため、共輸送タンパク質に他のイオンの輸送を停止するように信号を送ります。これが、発酵後期に窒素を添加しても、窒素の細胞内輸送機構が停止するため、ほとんど効果がないか全くない理由の一つです。[ 4 ]

アンモニア化合物

2 つのバケツに赤ワインの原液が入っています。上のバケツでは、ワインにリン酸二アンモニウム (アンモニア塩基) を加えた後に青みがかった色に変化しています。

発酵中、アンモニウムは酵母が利用できる同化可能な窒素の主な形態です。[ 1 ]しかし、圧搾時の果汁には、ブドウ畑でブドウの木が受け取った窒素の量に応じて、0～150 mg/Lのアンモニウム塩が含まれることがあります。[ 4 ]

細胞内では、無機アンモニアとアンモニウムイオンが一連の化学反応によって「固定」され、最終的に有機窒素源であるグルタミン酸が生成されます。[ 2 ]アンモニウムイオンは、解糖系で使用される酵素の1つに対するアロステリック制御因子としても機能し、酵母細胞がグルコースとフルクトースを細胞内に輸送する方法にも影響を与える可能性があります。[ 4 ]主要なグルコース輸送系で使用されるタンパク質の半減期は12時間であることが示されています。酵母細胞を「アンモニア飢餓」状態に置いた研究では、50時間後にシステム全体が停止しました。これは、アンモニア/アンモニウムの不足が発酵の停滞リスクを高める可能性があることを強く示唆しています。[ 3 ]

グルタチオン（GSH：L-γ-グルタミル-L-システイニルグリシン）は酵母細胞中に最大10 mMの高濃度で存在し、硫黄および窒素飢餓への応答において重要な役割を果たします。[ 6 ]

アンモニアは酢酸菌やマロラクティック発酵に用いられる乳酸菌などの細菌には利用されない。[ 2 ]

ワイン造りにおける重要性

同化性窒素は、ワイン酵母にとって発酵を完全に完了させ、望ましくない副産物（例えば、異臭の原因となる硫化水素などの化合物）を最小限に抑えるために必要な必須栄養素です。発酵過程において、酵母は最大1000 mg/Lのアミノ酸を消費しますが、多くの場合、必要量よりもはるかに少ない量しか消費しません。[ 2 ]酵母はアミノ酸を細胞内液胞に貯蔵し、後日、タンパク質に組み込んで直接使用するか、分解して炭素と窒素の成分を個別に使用します。[ 4 ]

窒素が欠乏すると、酵母は活動を停止し、死滅し始めます。一部の菌株は、システインやメチオニンなどの硫黄含有アミノ酸を分解し、硫黄原子を放出します。この硫黄原子は水素と結合して硫化水素（H2H 2 S ) はワインに腐った卵のような臭いを与えることがあります。しかし、酵母は窒素が豊富でも他の重要な栄養素（ビタミンであるパントテン酸など）が不足していてもH 2 Sを生成するため、YANレベルと硫化水素生成には直接的な相関関係はありません。S . cerevisiaeの中には、利用可能な窒素が多すぎる（特にグルタミン酸とアラニンが多すぎる）ことに反応してH 2 Sを生成する菌株も存在します[ 3 ] 。そのため、すべての発酵に無差別に窒素を補給するという予防的アプローチでは、H 2 Sを防ぐという望ましい結果が得られない可能性があります[ 2 ]。

サッカロミセス・セレビシエは、細胞に必要なときまでアミノ酸を液胞内に貯蔵することができます。

ワイン中の窒素濃度は、多くの芳香化合物の合成を含む、ワインの官能的側面に影響を及ぼす可能性があります。フーゼルアルコールはアミノ酸の分解によって生成されますが、アンモニアと尿素の濃度が高い場合、その生成量は減少します。利用可能な窒素が限られている場合、口当たりに影響を与える可能性のあるグリセロールとトレハロースのレベルが高くなります。[ 3 ]

必要な量の見積もり

必要なYANの量は、ワインメーカーの発酵目標、特に野生発酵を希望するかどうか、あるいはワインを完全に乾燥発酵させるかどうかによって異なります。ブドウの状態と発酵条件は、必要な窒素量に影響を与えます。損傷、カビ、または灰色カビ病に感染した果実は、畑から運び込まれた時点で、清潔で無傷のブドウよりも窒素（およびその他のビタミン源）が枯渇しているのが一般的です。この枯渇は、マストの過剰な清澄化や糖度の高さによってさらに悪化する可能性があります。高温で発酵させたワインは、発酵の進行が速い傾向があり、より長く低温で発酵させたワインよりも多くの窒素を必要とします。また、酸素への曝露量も酵母による窒素吸収速度に影響を与えます。完全な嫌気条件下で発酵させたワイン（ステンレススチールタンクで発酵させた多くの白ワインなど）は、樽や開放式発酵槽で発酵させたワインよりも窒素を必要としません。[ 7 ]

醸造学者が推奨する範囲は、1リットルあたり150 mgのYAN [ 8 ]から窒素400 mgまでです。[ 9 ]いくつかの研究では、YANが400～500 mg N/Lの範囲で最大発酵速度が達成できることが示されています。[ 10 ]しかし、すべてのワインメーカーが、酵母バイオマス、温度、速度の観点から最大速度で発酵を行うことを望んでいるわけではありません。これは、香りの発達や果実の保持など、ワインの他の感覚的側面に影響を及ぼす可能性があるためです。[ 3 ]

カリフォルニア大学デービス校ブドウ栽培・醸造学部の研究では、多くの酵母や栄養素メーカーが採用している収穫時の糖度レベルに基づいて、発酵を成功させるための最適な窒素レベルを推奨できることがわかりました。[ 11 ] [ 12 ]

  • 21°Bx = 200 mg N/L
  • 23°Bx = 250 mg N/L
  • 25°Bx = 300 mg N/L
  • 27°Bx = 350 mg N/L

しかし、他の研究では、YANレベルがこれらの推奨値を下回っていても発酵が成功することや、YANレベルが推奨値と一致していても発酵が遅くなったり停止したりすることが示されています。[ 1 ]

マロラクティック発酵において

マロラクティック発酵接種パケットとアミノ酸を含む栄養補助食品Optimalo。

酵母と同様に、マロラクティック発酵に用いられる乳酸菌（LAB）（一般的にはOenococcus oeni）は窒素を必要とする。しかし、S. cerevisiaeとは異なり、LABはアンモニアを利用できないため、リン酸二アンモニウム（DAP）などの添加物には栄養上の利点がない。ワインメーカーがMLF接種の際にDAPを栄養添加物として誤って使用すると、ブレタノマイセスなどの腐敗菌に栄養を与えてしまうリスクがある。[ 2 ]

一部のワインメーカーはLABに窒素を含む栄養素を接種しますが、MLFに必要な栄養素のほとんどは、死んだ酵母細胞の分解（または自己分解）から得られます。さらに、MLFで使用されるほとんどの細菌は、細胞外プロテアーゼ酵素を産生する能力を持っており、この酵素はより大きなペプチド鎖を代謝に利用できる基本アミノ酸残基に分解します。[ 4 ]

測定とテスト

o-フタルジアルデヒドによる窒素分析（NOPA）は、335 nmの波長で測定可能な分光光度計を用いて、ブドウジュース中の利用可能な第一級アミノ酸を測定するために使用されます。この分析は第一級アミノ酸のみを測定するため、結果にはプロリンやアンモニアの濃度は含まれません。[ 13 ]プロリンは、ギ酸存在下でニンヒドリンをアミノ酸と反応させ、517 nmで吸収される化合物を生成する分析法で別途測定できます。[ 1 ]

YAN レベルは、NOPA アッセイと分光光度計を使用して測定できます。

1907年にデンマークの化学者SPLソーレンセンによって発明されたホルムアルデヒド滴定法は、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムの存在下でホルムアルデヒドを用い、 pHメーターを用いてアミノ酸濃度とアンモニア濃度を測定する方法です。試薬はプロリンとも反応するため、NOPAよりもわずかに高いYAN値を示すことがあります。[ 14 ]また、ホルムアルデヒド法には、発がん性物質として知られるホルムアルデヒド[ 15 ]と、毒性の高い塩化バリウム[ 1 ]の使用と廃棄を伴うという欠点もあります。

アンモニアとアンモニウムはイオン選択電極プローブとpHメーターを用いて測定することができる。[ 1 ]

窒素補給

ワインメーカーは古くから、他のワインのポマス（圧搾後に残る固形の皮、種子、残渣）を醸造に添加すると、発酵がより予測可能になり「より健康的」になることを知っていました。これは、イタリアワイン「リパッソ」の製造に現在も用いら​​れている方法です。14世紀のトスカーナでは、初期のキャンティワインの一部に用いられた「ガヴェノ」という技法で、乾燥ブドウを醸造に添加していました。[ 16 ]この技法によって糖分も添加されましたが、どちらの方法も皮や種子に残っている窒素やその他の栄養素を補うことができました。[ 17 ]

尿素。

醸造学者が発酵の科学をより深く理解するにつれて、窒素が主要な栄養素として認識され、ワインメーカーは1900年代初頭からブドウ果汁にアンモニウム塩を添加し始めました。 [ 4 ]尿素も初期の窒素補給剤として使用されていましたが、エチルカルバメートの開発に関連する研究により、 1990年以降、米国を含む多くの国で禁止されています。 [ 2 ] [ 18 ] [ 19 ]

ワインメーカーが使用できる窒素サプリメントには様々な種類があります。その多くは、窒素（アミノ酸またはアンモニウム塩由来）に加え、ビタミン、ミネラル、その他の成長因子を含む複合製剤で、Go-Ferm、Superfood、Fermaid K（後者2つにはDAPも含まれています）などのブランド名で販売されています。[ 2 ]アミノ酸はマストに直接添加できますが、2010年現在、アメリカ合衆国ではマストへの添加はグリシンのみが許可されています。 [ 4 ]

Fermaid-O は、酵母殻（アミノ酸の供給源）とその他のビタミンを含み、リン酸二アンモニウムを含まない窒素サプリメントです。

酵母殻（または酵母ゴースト）は、接種用酵母株の商業生産から残った酵母細胞壁の残骸です。アミノ酸由来の同化可能な窒素源となるだけでなく、細胞が細胞膜を強化するために利用できる脂質やステロールも提供し、他の窒素源の取り込みを可能にします。 [ 2 ]

過剰に追加することのリスク

窒素補給、特にDAPは酵母の増殖を刺激し、バイオマスを大幅に増加させる可能性があります。その結果、ワインメーカーが望むよりも早く発酵速度が上昇し、酵母の発熱によって発酵温度も上昇する可能性があります。また、過剰なバイオマスは、ビタミンやステロールなどの酵母栄養素の不足を引き起こし、競合を激化させ、異臭（硫化水素など）の発生や発酵の停滞につながる可能性があります。[ 1 ]

アミノ酸の一種であるアルギニンの濃度が過剰（400 mg/Lを超える）になると、特に発酵終盤においてエチルカルバメートの生成が増加するリスクがあります。これは、アルギニンが尿素に分解され、酵母によって再吸収・利用されるか、アンモニアに代謝されるためです。しかし、尿素は完全に代謝されない場合、エタノールとも反応し、長期曝露（および高温）と相まって、エチルカルバメートエステルの生成につながる可能性があります。[ 1 ]

ブレタノマイセスは、ワインに残っている過剰な窒素補給を利用できる腐敗菌の 1 つです。

しかし、マストへの過剰な補給の最大のリスクは、発酵が完了した後も過剰な窒素やその他の栄養素が残ってしまうことです。腐敗菌がこれらの過剰な栄養素を利用することで、微生物の不安定化を引き起こす可能性があります。[ 3 ]

ワインに関する法律と規制

アメリカ合衆国では、アルコール・タバコ税貿易局（TTB）が窒素添加物としてのリン酸二アンモニウムの使用を968 mg/L（8ポンド/1000ガロン）に制限しており、これは窒素窒素（YAN）換算で203 mg/Lに相当する。欧州連合（EU）では、ほとんどの国が国際ブドウ・ワイン機構（OIV）のガイドラインに従っており、300 mg/Lという制限値となっている。オーストラリアでは、この制限値は無機リン酸の含有量に基づいており、最大400 mg/Lまで許容されている。[ 2 ]

タイミングの影響

ほとんどの栄養補助食品は、マスト中のすべての微生物に（望ましいかどうかにかかわらず）栄養を与えてしまうため、ワインメーカーは、望ましいS. cerevisiae株をマストに接種する準備ができるまで、栄養剤の添加を待つことがよくあります。天然発酵を行う生産者は、二酸化硫黄の添加によって不要な微生物が死滅するまで待つ場合もあれば、他の微生物がワインにもたらす可能性のある複雑な風味を期待して、早めに栄養剤を添加する場合もあります。添加される窒素は通常、アミノ酸の形で、ビタミンやミネラルと組み合わさって発酵を促進します。[ 2 ]

酵母接種物(左)を最初に再水和すると、DAP 内のアンモニウム塩は毒性が強すぎるため、ワイン製造者は窒素源として主にアミノ酸を含む栄養補助食品(右)を使用することが多いです。

接種後すぐに、酵母は利用可能な同化可能な窒素を急速に消費し始め、発酵が本格化するまでにYANの最大46%が完全に消費されます。[ 1 ] DAPに含まれるアンモニウム塩などの無機窒素は、高濃度では酵母にとって毒性があるため、新たに再水和した酵母のバイオマスが低い接種時には、DAPを添加することはありません。多くのワインメーカーは、DAPの添加を分割し、最初の添加は、酵母が指数関数的増殖期に入りアルコール発酵が始まるラグ期の終わりに行います。ほとんどのマストでは、これは接種後約48～72時間です。 2回目の添加は、糖発酵の3分の1程度が経過した時点で、糖度が12～10ブリックス（6.5～5.5ボーメ度、48.3～40.0エクスレ度）に達する前に行われることが多い。これは、発酵が進むにつれて、細胞を取り囲むエタノールの毒性が増すため、酵母細胞が窒素を細胞内に取り込むことができなくなるためである。その結果、窒素は利用されず、後から発生する腐敗菌に利用されてしまう。[ 2 ] [ 3 ]

参考文献

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  2. ^ a b c d e f g h i j k l m n K. Fugelsang、C. Edwardsワイン微生物学第2版 16-17、35、115-117、124-129ページ Springer Science and Business Media、ニューヨーク (2010) ISBN 0387333495
  3. ^ a b c d e f g h i R. Jackson 「ワイン科学：原理と応用」第3版、90-98、151、167、183、305-310、356-357、375-387、500、542ページ、Academic Press、2008年、ISBN 9780123736468
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