オリゴヌクレオチド

オリゴヌクレオチドは短いDNAまたはRNA分子（オリゴマー）であり、遺伝子検査、研究、法医学において幅広い用途があります。一般的には実験室で固相化学合成によって作られ[ 1 ]、これらの核酸の小さな断片は、ユーザーが指定した配列を持つ一本鎖分子として製造できるため、人工遺伝子合成、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、DNA配列決定、分子クローニング、分子プローブとして不可欠です。自然界では、オリゴヌクレオチドは通常、遺伝子発現の調節として機能する小さなRNA分子（例：マイクロRNA）として存在するか、[ 2 ]より大きな核酸分子の分解から得られる分解中間体です。

オリゴヌクレオチドは、分子全体を構成するヌクレオチド残基の配列によって特徴付けられます。オリゴヌクレオチドの長さは通常、「 -mer」（ギリシャ語の「部分」を意味するmerosに由来）で表されます。例えば、6ヌクレオチド（nt）のオリゴヌクレオチドはヘキサマー（六量体）であり、25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは通常「25-mer」と呼ばれます。オリゴヌクレオチドは、配列特異的に、それぞれの相補的なオリゴヌクレオチド、DNA、またはRNAに容易に結合し、二本鎖を形成します。また、頻度は低いものの、より高次のハイブリッドを形成することもあります。この基本的な特性は、オリゴヌクレオチドをDNAまたはRNAの特定の配列を検出するためのプローブとして使用する際の基盤となっています。オリゴヌクレオチドを使用する手法の例としては、DNAマイクロアレイ、サザンブロット、ASO分析、[ 3 ]蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、PCR、人工遺伝子の合成などが挙げられます。

オリゴヌクレオチドは2'-デオキシリボヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）から構成され、骨格または2'糖鎖部位を修飾することで、様々な薬理効果を発揮します。これらの修飾によりオリゴヌクレオチドは新たな特性を獲得し、アンチセンス療法における重要な要素となります。[ 4 ] [ 5 ]

合成

オリゴヌクレオチドは、天然または化学的に修飾されたヌクレオシド、あるいは程度は低いものの非ヌクレオシド化合物からなる保護されたホスホラミダイトを構成要素として用いて化学合成される。オリゴヌクレオチド鎖の組み立ては、「合成サイクル」と呼ばれる定型的な手順に従って3'から5'方向へ進行する。1回の合成サイクルが完了すると、成長中の鎖に1つのヌクレオチド残基が付加される。各合成ステップの収率は100%未満であり、副反応が発生するため、このプロセスの効率には実質的な限界がある。一般に、オリゴヌクレオチド配列は短い（13～25ヌクレオチド長）。[ 6 ]合成オリゴヌクレオチドの最大長は200ヌクレオチド残基を超えることはほとんどない。目的の配列を持つ生成物を単離するために、 HPLCなどの手法を用いることができる。

化学修飾

化学的に安定した短いオリゴヌクレオチドの作製は、ASO療法の開発における初期の課題でした。天然に存在するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを切断する酵素であるヌクレアーゼによって容易に分解されます。ヌクレアーゼはあらゆる細胞種に豊富に存在します。[ 7 ]また、短いオリゴヌクレオチド配列は弱い固有の結合親和性を有しており、これが生体内での分解に寄与しています。[ 8 ]

バックボーンの改変

ヌクレオチドのヌクレオシド有機チオリン酸（PS）類似体は、オリゴヌクレオチドにいくつかの有益な特性を与える。PSバックボーンがヌクレオチドに与える主な有益な特性は、各ヌクレオチドのジアステレオマー識別と、オリゴヌクレオチド合成に有用なホスホロチオエートヌクレオチドを含む反応の容易な追跡能力である。[ 9 ]オリゴヌクレオチドのPSバックボーン修飾は、酵素による望ましくない分解からオリゴヌクレオチドを保護する。[ 10 ]ヌクレオチドバックボーンの修飾は、ほとんどのヌクレオチドに対して比較的容易かつ正確に行うことができるため、広く使用されている。[ 9 ]オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端の蛍光修飾は、環境に対するオリゴヌクレオチドの構造、ダイナミクス、相互作用を評価するために報告されている。[ 11 ]

シュガーリングの改造

オリゴヌクレオチドの医療用途に有用なもう一つの修飾は、2'位糖鎖修飾である。2'位糖鎖を修飾することで、オリゴヌクレオチドの標的結合能力が向上し、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド療法においてオリゴヌクレオチドの有効性が高まる。[ 8 ] また、非特異的タンパク質結合を減少させ、特定のタンパク質への標的化の精度を向上させる。[ 8 ] 最も一般的に用いられる修飾は、2'-O-メチル基と2'-O-メトキシエチル基である。[ 8 ]核酸塩基への蛍光修飾も報告されている。[ 11 ]

アンチセンスオリゴヌクレオチド

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）は、選択された配列に相補的なDNAまたはRNAの一本鎖である。[ 6 ]アンチセンスRNAの場合、ハイブリダイゼーションと呼ばれるプロセスで、特定のメッセンジャーRNA鎖に結合し、タンパク質の翻訳を阻害する。[ 12 ]アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の相補的な（コーディングまたは非コーディング）RNAを標的とするために使用することができる。結合が起こると、このハイブリッドはRNase H酵素によって分解される。[ 12 ] RNase HはRNAを加水分解する酵素であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの用途で使用すると、mRNA発現の80～95%のダウンレギュレーションをもたらす。[ 6 ]

モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた脊椎動物の遺伝子ノックダウンは、現在では発生生物学の標準技術であり、遺伝子発現や遺伝子機能の変化を研究するために用いられています。この手法は、ジャネット・ヒースマンがアフリカツメガエルを用いて初めて開発しました。[ 13 ] FDA承認のモルフォリノ系薬剤には、エテプリルセンとゴロディルセンがあります。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞株におけるインフルエンザウイルスの複製を阻害するためにも使用されています。[ 14 ] [ 15 ]

単一の変異タンパク質が原因で起こる神経変性疾患は、非常に特異的なRNA配列を高い選択性で標的とし、改変する能力があるため、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法の良い標的である。[ 3 ]ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの多くの遺伝性疾患は、誤ったRNA配列をもたらし、毒性のある生理学的効果を持つタンパク質の誤翻訳をもたらすDNAの変異に関連している。[ 16 ]

細胞の内部化

細胞への取り込み/内部移行は、依然としてオリゴヌクレオチド（ON）治療薬の成功に向けた最大のハードルとなっている。ほとんどの低分子医薬品と同様に、ONのポリアニオン骨格と分子サイズにより、直接的な取り込みが妨げられる。取り込みと作用部位への細胞内輸送の正確なメカニズムは、依然として大部分が不明である。さらに、ONの構造/修飾のわずかな違い（前述参照）と細胞の種類の違いが、取り込みに大きな違いをもたらす。細胞表面へのONの吸着後、異なる経路で細胞取り込みが起こると考えられている。特に、研究により、ほとんどの組織培養細胞はASO（ホスホロチオート結合）を非生産的に容易に取り込むことが示されており、これはアンチセンス効果が観察されないことを意味する。それとは対照的に、ASOをG共役受容体によって認識されるリガンドと結合させると、生産的な取り込みが増加する。[ 17 ]その分類（非生産的 vs. 生産的）の次に、細胞の内部化は主にエネルギー依存的方法（受容体介在性エンドサイトーシス）で進行しますが、エネルギー非依存的受動拡散（ジムノシス）も排除できません。細胞膜を通過した後、ON治療薬は初期エンドソームに封入され、後期エンドソームへと輸送され、最終的に低pHで分解酵素を含むリソソームと融合します。 [ 18 ] ONが治療機能を発揮するには、分解される前にエンドソームから脱出する必要があります。現在、送達、細胞への取り込み、エンドソーム脱出の問題を克服する普遍的な方法はありませんが、特定の細胞とその受容体に合わせたアプローチがいくつか存在します。[ 19 ]

ON治療薬を細胞認識/取り込みを担う物質に結合させると、取り込みが増加するだけでなく（上記参照）、主に1つの（理想的には既知の）メカニズムが関与するため、細胞取り込みの複雑さが減少すると考えられています。[ 18 ]これは、肝細胞の受容体を標的とするN-アセチルガラクトサミンなどを含む小分子ON結合体で達成されています。[ 20 ]これらの結合体は、対応する受容体が標的細胞上で過剰発現して標的治療薬につながるため、標的送達と組み合わせた細胞取り込みの増加を実現するための優れた例です（がん細胞上で過剰発現した受容体を利用する抗体薬物複合体と​​比較してください）。[ 19 ]オリゴヌクレオチドの標的送達と細胞取り込みの増加のために広く使用され、精力的に研究されているもう1つの物質は抗体です。

分析技術

クロマトグラフィー

アルキルアミドはクロマトグラフィーの固定相として使用することができる。 [ 21 ]これらの相はオリゴヌクレオチドの分離について研究されてきた。[ 22 ]イオン対逆相高速液体クロマトグラフィーは、自動合成後のオリゴヌクレオチドを分離・分析するために使用される。[ 23 ]

質量分析

5-メトキシサリチル酸とスペルミンの混合物は、 MALDI質量分析法におけるオリゴヌクレオチド分析のマトリックスとして使用することができる。[ 24 ]エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）もオリゴヌクレオチドの質量を特徴付ける強力なツールである。[ 25 ]

DNAマイクロアレイ

DNAマイクロアレイは、オリゴヌクレオチドの有用な分析アプリケーションです。標準的なcDNAマイクロアレイと比較して、オリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイは、ハイブリダイゼーションに対する特異性をより制御でき、選択的スプライシングまたはポリアデニル化配列の存在と頻度を測定できます。[ 26 ] DNAマイクロアレイのサブタイプの一つは、オリゴヌクレオチドが高密度に結合した基板（ナイロン、ガラスなど）です。[ 27 ]生命科学分野において、 DNAマイクロアレイは多くの用途があります。

参照

参考文献

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さらに読む

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