遺伝子工学技術

遺伝子工学技術は、動植物のゲノムを改変することを可能にします。特定の遺伝子の特定の塩基対から遺伝子全体に至るまで、 DNAを複数のレベルで挿入、削除、改変する技術が考案されています。遺伝子組み換え生物（GMO）が作られるまでには、いくつかの段階があります。遺伝子工学者はまず、挿入、改変、または削除したい遺伝子を選択する必要があります。次に、遺伝子を単離し、他の遺伝要素とともに適切なベクターに組み込む必要があります。このベクターを用いて遺伝子を宿主ゲノムに挿入することで、トランスジェニック生物、つまり編集された生物が作られます。

生物の遺伝子工学技術は、遺伝子の機能と操作に関する長年の研究と発見の上に築かれています。重要な進歩としては、制限酵素やDNAリガーゼの発見、そしてポリメラーゼ連鎖反応とシーケンシングの開発が挙げられます。

追加された遺伝子には、プロモーター領域とターミネーター領域、そして選択マーカー遺伝子が付随することがよくあります。追加された遺伝子自体も、より効率的に発現するように改変されることがあります。このベクターは、宿主生物のゲノムに挿入されます。動物の場合、遺伝子は通常、胚性幹細胞に挿入されますが、植物の場合は、完全に成長した植物体に培養できるあらゆる組織に挿入できます。

改変生物に対しては、安定した統合、遺伝、発現を保証するための試験が実施されます。第一世代の子孫はヘテロ接合体であるため、安定した遺伝に必要なホモ接合パターンを形成するには近親交配が必要です。第二世代の標本ではホモ接合性を確認する必要があります。

初期の技術では、遺伝子をゲノムにランダムに挿入していました。技術の進歩により、特定の部位を標的とすることが可能になり、意図しない副作用が減少しました。初期の技術では、メガヌクレアーゼとジンクフィンガーヌクレアーゼが利用されていました。2009年以降、より正確で導入が容易なシステムが開発されました。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）とCas9-ガイドRNAシステム（CRISPRを改変したもの）は、最もよく知られている2つのシステムです。

歴史

遺伝子工学の発展は、様々な発見と進歩によってもたらされました。人間による遺伝子操作は、紀元前1万2000年頃、人為選択による植物や動物の家畜化に始まります。 [ 1 ] : 1 育種と選抜を支援する様々な技術が開発されました。交雑は、生物の遺伝子構造に急速な変化をもたらす方法の一つでした。作物の交雑は、人間が近縁種の遺伝的に異なる個体を近距離で栽培し始めたときに初めて起こったと考えられます。[ 2 ] : 32 一部の植物は栄養クローンによって増殖することができました。[ 2 ] : 31

遺伝的継承は、1865年にグレゴール・メンデルによってエンドウ豆の交配実験によって初めて発見されました。[ 3 ] 1928年、フレデリック・グリフィスは 遺伝に関わる「変換原理」の存在を証明し、これは1944年にオズワルド・エイブリー、コリン・マクラウド、マクリン・マッカーティによってDNAであると特定されました。フレデリック・サンガーは1977年にDNA配列を解析する方法を開発し、研究者が利用できる遺伝情報を大幅に増加させました。

DNAの存在と特性が発見された後、それを操作するためのツールを開発する必要がありました。1970年にハミルトン・スミス研究室は制限酵素を発見し、科学者は生物のゲノムから遺伝子を分離できるようになりました。[ 4 ] 切断されたDNAを結合するDNAリガーゼは、1967年初頭に発見されました。 [ 5 ] 2つの酵素を組み合わせることで、DNA配列を「カットアンドペースト」して組み換えDNAを作成することができました。1952年に発見されたプラスミド[ 6 ]は、細胞間で情報を転送し、 DNA配列を複製するための重要なツールになりました。 1983年にキャリー・マリスが開発したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、DNAの小さな断片を増幅（複製）し、遺伝物質の識別と分離に役立ちました。

DNAを操作するだけでなく、生物のゲノムにDNAを挿入する技術も開発する必要があった。グリフィスの実験では、一部の細菌が外来DNAを自然に取り込み、発現する能力があることがすでに示されていた。 1970年には大腸菌を塩化カルシウム溶液（CaCl 2）で処理することにより、人工的にコンピテンスが誘導された。 [ 7 ]電気穿孔法を使用した形質転換は1980年代後半に開発され、効率と細菌の範囲が拡大した。[ 8 ] 1907年には植物の腫瘍を引き起こす細菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが発見された。1970年代初頭には、この細菌がTiプラスミドを使用して植物にDNAを挿入することが判明した。[ 9 ]腫瘍を引き起こすプラスミドの遺伝子を除去し、新しい遺伝子を追加することで、研究者らは植物にA.ツメファシエンスを感染させ、細菌に選択したDNAを植物のゲノムに挿入させることができた。[ 10 ]

標的遺伝子の選択

最初のステップは、宿主生物に挿入する標的遺伝子（複数可）を特定することです。これは、結果として得られる生物の目的によって決まります。場合によっては、1つまたは2つの遺伝子のみが影響を受けます。より複雑な目的の場合は、複数の遺伝子を含む生合成経路全体が関与することがあります。様々な生物から遺伝子やその他の遺伝情報が発見されると、それらを細菌に挿入して保存および改変することができ、その過程で遺伝子改変細菌を作り出すことができます。細菌は安価で、増殖しやすく、クローン性で、急速に増殖し、比較的容易に形質転換でき、-80℃でほぼ無期限に保存できます。遺伝子が単離されると、細菌内に保存することができ、研究のために無制限に供給することができます。[ 11 ]

遺伝子スクリーニングを実施して潜在的な遺伝子を特定し、その後、最適な候補遺伝子を特定するための他の検査を実施することができる。単純なスクリーニングでは、化学物質や放射線を用いてDNAをランダムに変異させ、目的の形質を示す遺伝子を選択する。変異が現実的でない生物の場合、科学者は代わりに、集団の中から自然発生的な変異によってその形質を示す個体を探す。表現型を観察し、その原因となる遺伝子を特定しようとするプロセスは、順方向遺伝学と呼ばれる。次に、表現型の遺伝を既知の遺伝子マーカーと比較することにより、遺伝子をマッピングする必要がある。互いに近接した遺伝子は、一緒に遺伝する可能性が高い。[ 12 ]

もう一つの選択肢は逆遺伝学である。このアプローチでは、特定の遺伝子を標的として変異を起こし、どのような表現型が現れるかを観察する。[ 12 ]変異は、遺伝子を不活性化するように設計することも、特定の条件下でのみ活性化するように設計することもできる。条件付き変異は、通常は機能しない場合に致命的となる遺伝子を特定するのに有用である。[ 13 ]類似の機能を持つ遺伝子は類似の配列（相同性）を共有するため、モデル生物から得られたよく研究されている遺伝子の配列と比較することで、遺伝子の機能を予測することができる。[ 12 ]マイクロアレイ、トランスクリプトーム、ゲノム配列解析の発達により、望ましい遺伝子を見つけることがはるかに容易になった。[ 14 ]

バチルス・チューリンゲンシスという細菌は、1901年にカイコの死因物質として初めて発見されました。この細菌は殺虫作用を持つことから、生物殺虫剤として使用され、1938年に商業的に開発されました。cryタンパク質が殺虫活性を持つことは1956年に発見され、1980年代までには科学者たちはこのタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、植物で発現させることに成功しました。[ 15 ]除草剤グリホサート への耐性をもたらす遺伝子は、モンサント社のラウンドアップ製造施設の排水管に生息する細菌の中で7年間の探索の末に発見されました。[ 16 ]動物では、使用される遺伝子の大部分は成長ホルモン遺伝子です。[ 17 ]

遺伝子操作

遺伝子工学のあらゆるプロセスはDNAの改変を伴います。伝統的にDNAは生物の細胞から単離されていました。その後、DNAライブラリーの作成後にDNA断片から遺伝子をクローン化したり、人工的に合成したりするようになりました。単離された遺伝子には、宿主生物内での発現を可能にし、選択を促進するために、追加の遺伝子要素が付加されます。

細胞からの抽出

まず細胞をやさしく開き、DNAを露出させるが、DNAへのダメージが大きすぎる場合はその都度取り除く。方法は細胞の種類によって異なる。細胞が開いたら、DNAを他の細胞成分から分離する必要がある。破裂した細胞にはタンパク質やその他の細胞残骸が含まれている。フェノールやクロロホルムと混合し遠心分離することで、核酸を残骸から上部の水相に分離することができる。この水相は除去し、必要に応じてフェノール・クロロホルム分離の手順を繰り返すことでさらに精製することができる。その後、エタノールまたはイソプロパノールを用いて水溶液から核酸を沈殿させることができる。RNAは、それを分解するリボヌクレアーゼを加えることで除去できる。現在、多くの企業がこのプロセスを簡素化するキットを販売している。[ 18 ]

遺伝子分離

研究者が改変しようとしている遺伝子（目的遺伝子）は、抽出したDNAから分離する必要があります。配列が不明な場合、一般的な方法はランダム消化法でDNAを分割することです。これは通常、制限酵素（DNAを切断する酵素）を用いて行われます。部分的な制限消化では、制限部位の一部のみが切断されるため、重複したDNA断片セグメントが生じます。DNA断片は個別のプラスミドベクターに入れられ、細菌内で増殖します。細菌内に入ると、細菌が分裂するにつれてプラスミドが複製されます。特定の断片に有用な遺伝子が存在するかどうかを判断するために、DNAライブラリを目的の表現型についてスクリーニングします。表現型が検出された場合、細菌に目的の遺伝子が含まれている可能性があります。

遺伝子に検出可能な表現型がない場合、またはDNAライブラリに適切な遺伝子が含まれていない場合、他の方法を用いて遺伝子を単離する必要があります。分子マーカーを用いて遺伝子の位置を特定できる場合、染色体ウォーキングは正しいDNA断片を単離する方法の一つです。遺伝子が他の種の既知の遺伝子と高い相同性を示す場合、ライブラリ内で既知の遺伝子とよく一致する遺伝子を検索することで単離できます。[ 19 ]

既知の DNA 配列の場合、遺伝子の両側の DNA を切断する制限酵素を使用することができます。次に、ゲル電気泳動で長さに応じて断片を分類します。[ 20 ]一部のゲルでは、1塩基対だけ異なる配列を分離できます。DNA は、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線下で撮影することで視覚化できます。長さがわかっている断片の付いたマーカーをDNA の横に置いて、各バンドのサイズを推測することができます。正しいサイズの DNA バンドには遺伝子が含まれているはずなので、ゲルから切り取ることができます。[ 18 ] : 40–41 配列がわかっている遺伝子を分離する別の技術として、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) があります。[ 21 ] PCR は、特定の配列を増幅できる強力なツールで、その後、ゲル電気泳動で分離できます。PCR の有効性は遺伝子が大きくなるにつれて低下し、配列にエラーが導入される可能性があります。

遺伝子を人工的に合成することは可能である。[ 22 ]いくつかの合成配列は市販されており、これらの初期段階の多くを省略することができる。[ 23 ]

修正

挿入される遺伝子は、適切に機能するために他の遺伝子要素と組み合わせられなければならない。遺伝子はこの段階で改変され、より良い発現や効果が得られる。挿入される遺伝子に加えて、ほとんどのコンストラクトにはプロモーター領域とターミネーター領域、および選択マーカー遺伝子が含まれている。プロモーター領域は遺伝子の転写を開始し、遺伝子発現の位置とレベルを制御するために使用できる。一方、ターミネーター領域は転写を終了させる。選択マーカーは、ほとんどの場合、それが発現される生物に抗生物質耐性を付与し、どの細胞が新しい遺伝子で形質転換されるかを決定するために使用される。コンストラクトは、制限酵素消化、ライゲーション、分子クローニングなどの組換えDNA技術を使用して作成される。[ 24 ]

宿主ゲノムへのDNAの挿入

遺伝子が構築されると、それは標的生物のゲノムに安定的に組み込まれるか、染色体外DNAとして存在する必要がある。遺伝子を宿主ゲノムに挿入する方法はいくつかあり、標的生物の種類によって異なる。多細胞真核生物では、導入遺伝子が宿主の生殖細胞に組み込まれると、宿主細胞はその子孫に導入遺伝子を伝えることができる。一方、体細胞に組み込まれると、導入遺伝子は遺伝しない。[ 25 ]

変換

細菌の形質転換とは、ある細菌から別の細菌へ遺伝子を移動させることです。遺伝子は受容者のプラスミドに組み込まれ、新しい宿主によって発現されます。

形質転換とは、遺伝物質を細胞膜に通過させることで細胞の遺伝成分を直接改変することです。細菌の約1%は自然に外来DNAを取り込むことができますが、この能力は他の細菌で誘導することができます。[ 26 ]熱ショックまたは電気穿孔法で細菌にストレスを与えると、細胞膜がDNAを透過できるようになり、ゲノムに組み込まれたり、染色体外DNAとして存在したりする可能性があります。通常、細胞は冷条件下で二価カチオン（多くの場合塩化カルシウム）を含む溶液中で培養され、その後熱パルス（熱ショック）に曝露されます。塩化カルシウムは細胞膜​​を部分的に破壊し、組み換えDNAが宿主細胞に侵入することを可能にします。冷条件下で細胞を二価カチオンに曝露すると、細胞表面構造が変化または弱まり、DNAの透過性が高まることが示唆されています。熱パルスは細胞膜全体に熱の不均衡を生み出し、DNAを細胞孔または損傷した細胞壁から細胞内に侵入させると考えられています。電気穿孔法は、コンピテンスを促進するもう一つの方法です。この方法では、細胞に10～20 kV /cmの電界を短時間印加します。これにより細胞膜に穴が開き、プラスミドDNAがそこから侵入できると考えられています。電気ショック後、穴は細胞の膜修復機構によって急速に閉じられます。取り込まれたDNAは、細菌ゲノムに組み込まれるか、より一般的には染色体外DNAとして存在します。

遺伝子銃はバイオリスティクスを使用して植物組織に DNA を挿入します。
ニンジン細胞に付着するA. tumefaciens

植物では、DNAはアグロバクテリウムを介した組み換えによって挿入されることが多く、[ 27 ]アグロバクテリウムのT-DNA配列を利用して遺伝物質を植物細胞に自然に挿入します。[ 28 ]植物組織を細かく切り、アグロバクテリウムを懸濁した液体に浸します。細菌は切り口から露出した多くの植物細胞に付着します。細菌は接合を利用してT-DNAと呼ばれるDNAセグメントをプラスミドから植物に転移させます。転移したDNAは植物細胞の核に導かれ、宿主植物のゲノムDNAに組み込まれます。プラスミドT-DNAは宿主細胞のゲノムに半ランダムに組み込まれます。 [ 29 ]

目的の遺伝子を発現するようにプラスミドを改変することで、研究者は選択した遺伝子を植物ゲノムに安定的に挿入することができます。T-DNAの必須部分は2つの小さな（25塩基対）ボーダーリピートのみであり、植物の形質転換には少なくともそのうちの1つが必要です。[ 30 ] [ 31 ]植物に導入する遺伝子は、プラスミドのT-DNA領域を含む植物形質転換ベクターにクローニングされます。代替方法として、アグロインフィルトレーション法があります。[ 32 ] [ 33 ]

植物細胞の形質転換に用いられるもう一つの方法はバイオリスティックスであり、金やタングステンの粒子をDNAでコーティングし、それを若い植物細胞や植物胚に注入する。[ 34 ]遺伝物質の一部が細胞内に入り、細胞を形質転換する。この方法はアグロバクテリウム感染に感受性のない植物にも使用でき、植物プラスチドの形質転換も可能である。植物細胞は電気穿孔法を用いて形質転換することもできる。電気穿孔法では、電気ショックを用いて細胞膜をプラスミドDNAの透過性にする。細胞とDNAに生じる損傷のため、バイオリスティックスと電気穿孔法の形質転換効率はアグロバクテリウムによる形質転換よりも低い。

トランスフェクション

形質転換は動物に関しては意味が異なり、癌状態への進行を示すため、動物細胞に外来DNAを挿入するプロセスは通常、トランスフェクションと呼ばれます。 [ 35 ]試験管内で動物細胞にDNAを直接導入する方法は多数あります。これらの細胞は多くの場合、遺伝子治療に用いられる幹細胞です。化学ベースの方法では、天然または合成化合物を用いて、細胞への遺伝子導入を促進する粒子を形成します。[ 36 ]これらの合成ベクターはDNAに結合し、大量の遺伝子導入に対応する能力があります。[ 37 ]最も簡単な方法の1つは、リン酸カルシウムを用いて DNAを結合し、それを培養細胞に曝露することです。溶液はDNAと共に細胞に包み込まれます。 [ 38 ]リポソームとポリマーは、培養された動物細胞にDNAを送達するためのベクターとして使用することができます。正に帯電したリポソームはDNAと結合し、ポリマーはDNAと相互作用するように設計できます。[ 36他の技術としては、電気穿孔法やバイオリスティックスの使用が挙げられる。[ 39 ]場合によっては、トランスフェクションされた細胞は外部DNAを自身のゲノムに安定的に組み込むことがあり、このプロセスは安定トランスフェクションとして知られている。[ 40 ]

トランスジェニック動物を作出するには、DNAを生存可能な胚または卵子に挿入する必要がある。これは通常、マイクロインジェクションを用いて行われ、DNAは細胞の核膜を通して核に直接注入される。[ 26 ]過剰排卵させた受精卵は単細胞段階で採取され、体外培養される。精子頭部と卵子の前核が原形質を通して見えるようになったら、遺伝物質をその一方に注入する。その後、卵母細胞は偽妊娠動物の卵管に移植される。[ 41 ]もう一つの方法は、胚性幹細胞を介した遺伝子移入である。遺伝子を胚性幹細胞に導入し、それをマウスの胚盤胞に挿入し、さらに仮親に移植する。結果として生じる子孫はキメラであり、さらに交配することで、目的の遺伝子を完全に導入したマウスを作り出すことができる。[ 42 ]

伝達

形質導入は、外来DNAをウイルスまたはウイルスベクターによって細胞に導入するプロセスである。[ 43 ]遺伝子組み換えウイルスは、遺伝子治療において標的遺伝子を別の生物に伝達するためのウイルスベクターとして使用することができる。[ 44 ]まず、毒性遺伝子をウイルスから除去し、代わりに標的遺伝子を挿入する。ウイルスが遺伝子を宿主生物に挿入できるようにする配列は、そのまま残しておかなければならない。一般的なウイルスベクターは、レトロウイルスまたはアデノウイルスから開発されている。ベクターとして使用される他のウイルスには、レンチウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスなどがある。使用するウイルスの種類は、標的細胞と、DNAを永久的に変更するのか一時的に変更するのかによって決まる。

再生

多くの場合、遺伝物質で形質転換されるのは単一の細胞だけなので、その単一細胞から生物を再生する必要がある。植物では、これは組織培養を用いて行われる。[ 45 ] [ 46 ]植物種ごとに、再生を成功させるための要件は異なる。再生が成功すれば、この技術により、すべての細胞に導入遺伝子を含む成体植物が生成される。[ 47 ]動物では、挿入されたDNAが胚性幹細胞内に存在することを確認する必要がある。[ 27 ]子孫は遺伝子についてスクリーニングすることができる。第1世代のすべての子孫は、挿入された遺伝子についてヘテロ接合性であるため、ホモ接合性の標本を生成するためには近親交配を行う必要がある。細菌は単一細胞で構成され、クローン的に再生するため、再生は不要である。選択マーカーを使用すると、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞を簡単に区別することができる。

DNAで形質転換された細胞はマーカー遺伝子を含みますが、形質転換されなかった細胞は含みません。その遺伝子を発現する細胞を選択または標識する抗生物質または化学物質の存在下で細胞を培養することで、改変された細胞と改変されていない細胞を分離することが可能です。別のスクリーニング方法としては、挿入された遺伝子にのみ結合するDNAプローブを用いる方法があります。これらのマーカーは通常、トランスジェニック生物に存在しますが、成熟したトランスジェニック植物から選択マーカーを除去するためのいくつかの戦略が開発されています。[ 48 ]

確認

組み換え生物に挿入された遺伝子が含まれていることがわかっても、それが意図した組織で適切に発現されることを保証するのに通常は十分ではありません。PCR、サザンハイブリダイゼーション、DNA配列決定を使用した更なる試験が、生物が新しい遺伝子を含んでいることを確認するために行われます。[ 49 ]これらの試験では、挿入された遺伝子の染色体上の位置とコピー数も確認できます。確認されたら、遺伝子産物（RNAとタンパク質）を探して測定する方法も、遺伝子発現、転写、RNAプロセシングパターン、タンパク質産物の発現と局在を評価するために使用されます。これらには、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的RT-PCR、ウエスタンブロット、免疫蛍光、ELISA、表現型分析が含まれます。[ 50 ]適切な場合、生物の子孫が研究され、導入遺伝子と関連する表現型が安定して遺伝することを確認します。

遺伝子挿入標的化

従来の遺伝子工学の手法では、一般的に新しい遺伝物質を宿主ゲノム内にランダムに挿入します。これにより、生物体内の他の遺伝子が損傷または改変される可能性があります。そこで、生物ゲノム内の特定の部位に新しい遺伝物質を挿入する方法が開発されました。ゲノム内の特定の部位の遺伝子を標的とする初期の手法は、相同組換え（HR）に依存していました。[ 51 ]標的ゲノム配列に一致するテンプレートを含むDNA構造を作成することで、細胞内のHRプロセスによって目的の部位に構造が挿入される可能性があります。この手法を胚性幹細胞に適用することで、標的遺伝子をノックアウトしたトランスジェニックマウスが開発されました。また、遺伝子をノックインしたり、遺伝子発現パターンを変化させたりすることも可能になっています。 [ 52 ]

重要な遺伝子がノックアウトされると、生物にとって致命的となる可能性があります。これらの遺伝子の機能を研究するために、部位特異的リコンビナーゼ（SSR）が用いられました。最も一般的な2つのタイプは、Cre-LoxPシステムとFlp-FRTシステムです。Creリコンビナーゼは、Lox-P部位として知られる結合配列間の相同組換えによってDNAを除去する酵素です。Flip-FRTシステムも同様の働きをし、FlipリコンビナーゼはFRT配列を認識します。対象遺伝子の両側にリコンビナーゼ部位を持つ生物と、組織特異的プロモーターの制御下でSSRを発現する生物を交配することで、特定の細胞のみで遺伝子をノックアウトまたは発現させることができます。これは、トランスジェニック動物からマーカー遺伝子を除去するためにも使用されています。これらのシステムをさらに改良することで、研究者は特定の条件下でのみ組換えを誘導できるようになり、所望の時期または発生段階で遺伝子をノックアウトまたは発現させることが可能になりました。[ 52 ]

ゲノム編集では、人工的に改変されたヌクレアーゼを用いて、 ゲノムの所望の位置に特定の二本鎖切断を生じさせます。切断部は細胞内のDNA修復プロセスに晒され、標的遺伝子のノックアウト、修正、または挿入を高頻度で行うことができます。適切な配列（相同性）を含むドナーDNAが存在する場合、相同組換えによって、導入遺伝子を含む新たな遺伝物質が標的部位に高効率に組み込まれます。[ 53 ]人工ヌクレアーゼには4つのファミリーがある：メガヌクレアーゼ、[ 54 ] [ 55 ] ZFN、[ 56 ] [ 57 ]転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、[ 58 ] [ 59 ] CRISPR /Cas（クラスター化された規則的に間隔を置いた短い回文反復配列/CRISPR関連タンパク質（例：CRISPR/Cas9））。[ 60 ] [ 61 ] 4つのタイプのうち、TALENとCRISPR/Casの2つが最も一般的に使用されている。[ 62 ]最近の進歩は、両方の最良の特徴を利用するために複数のシステムを組み合わせることに注目している（例：TALE DNA結合ドメインとメガヌクレアーゼの融合であるメガTAL）。[ 63 ]最近の研究では、二本鎖DNAを作成せずに遺伝子ノックアウトまたは修正を作成する戦略の開発にも焦点が当てられている。ブレーク（ベースエディター）[ 62 ]

メガヌクレアーゼとジンクフィンガーヌクレアーゼ

メガヌクレアーゼは1988年に哺乳類細胞で初めて使用されました。[ 64 ]メガヌクレアーゼは長い認識部位を持つ制限酵素として機能するエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、他の制限酵素よりも標的部位への特異性が高くなっています。これにより特異性が向上し、ゲノム内の多くの部位を標的としないため毒性が低下します。最も研究されているメガヌクレアーゼはLAGLIDADGファミリーです。メガヌクレアーゼはオフターゲット結合の影響を依然として受けやすく、他の遺伝子編集ツールほど魅力的ではありませんが、その小型化は、特にウイルスベクター化の観点から依然として魅力的です。[ 65 ] [ 53 ]

1996年に初めて使用されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、通常、ジンクフィンガードメインとFok Iヌクレアーゼドメインの融合によって作成されます。したがって、ZFNは標的部位でDNAを切断する能力があります。[ 53 ]ジンクフィンガードメインをゲノム内の特定の部位を標的とするように設計することにより、目的の位置でゲノム配列を編集することが可能になります。[ 65 ] [ 66 ] [ 53 ] ZFNはより高い特異性を備えていますが、非特異的な配列に結合する可能性も依然として残っています。ある程度のオフターゲット切断はトランスジェニックモデル生物を作成するために許容されますが、すべてのヒト遺伝子治療治療に最適であるとは限りません。[ 65 ]

TALENとCRISPR

2009年に転写活性化因子様エフェクター（TALE）によるDNA認識を制御するコードへのアクセスが開かれ、新しいクラスの効率的なTALベースの遺伝子編集ツールの開発への道が開かれました。TALEは、キサントモナス植物病原体によって分泌されるタンパク質で、植物宿主内の遺伝子に非常に特異的に結合し、 感染を助ける遺伝子の転写を開始します。DNA結合コアをFok Iヌクレアーゼ触媒ドメインに融合させることでTALEを改変し、新しいデザイナーヌクレアーゼツールであるTALEヌクレアーゼ（TALEN）を作成することができました。[ 67 ]これらは、現在改変されているすべてのヌクレアーゼの中で最も優れた特異性を持つものの1つです。反復配列が存在するため、標準的な分子生物学の手順で構築することは困難であり、ゴールデンゲートクローニングなどのより複雑な方法に依存しています。[ 62 ]

2011 年には、細菌や古細菌で適応免疫システムとして機能する CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat / CRISPR associate protein) システムをベースにした、もう 1 つの大きなブレークスルー技術が開発されました。CRISPR/Cas システムにより、細菌や古細菌はウイルス DNA を切断し、その DNA の一部を自身のゲノムに挿入することで、侵入してきたウイルスと戦うことができます。次に、生物はこの DNA をRNAに転写し、この RNA をCas9タンパク質と組み合わせて、侵入してきたウイルス DNA の二本鎖切断を行います。この RNA はガイド RNA として機能し、Cas9 酵素をウイルス DNA の正しい場所に導きます。Cas タンパク質を設計されたガイド RNA と組み合わせることで、CRISPR/Cas9 を使用して DNA 配列内の特定のポイントで二本鎖切断を誘発することができます。切断は細胞の DNA 修復酵素によって修復され、ほとんどの場合、小さな挿入/削除タイプの変異が作成されます。標的DNA修復は、所望の変化を表すドナーDNAテンプレートを提供することで可能となり、相同組換えによる二本鎖切断修復に（場合によっては）用いられる。後に、CRISPR/Cas9はシャーレ内でヒト細胞を編集できることが実証された。初期世代はTALENのような特異性は備えていないものの、この技術の主な利点は設計の簡便性にある。また、複数の部位を同時に標的とすることができるため、複数の遺伝子を一度に編集することができる。CRISPR /Cpf1は、CRISPR /Cas9と比較して、特定の二本鎖切断（DNAを切断する際にオーバーハングを残す）を作成するために異なるガイドRNAを必要とする、最近発見されたシステムである。 [ 62 ]

CRISPR/Cas9は遺伝子破壊に効果的です。中国の研究者He Jiankui氏によるHIV耐性ベビーの誕生は、おそらくこの手法を用いた遺伝子破壊の最も有名な例でしょう。[ 68 ]遺伝子修正にははるかに効果が低いです。現在開発中の塩基編集法では、「ヌクレアーゼ不活性」Cas9エンドヌクレアーゼまたは関連酵素を遺伝子標的に用い、連結されたデアミナーゼ酵素がDNAの標的塩基を変化させます。[ 69 ] CRISPR/Cas9の最新の改良法はプライム編集と呼ばれています。この方法は、逆転写酵素とRNA誘導型の人工ヌクレアーゼを連結し、一本鎖切断のみを行い二本鎖切断は行いません。ヌクレアーゼと逆転写酵素の連続的な作用によって切断部位に隣接するDNA部分を置換し、RNA鋳型から目的の変化を導入します。[ 70 ]

参照

参考文献

  1. ^ Root C (2007). Domestication . Greenwood Publishing Groups. ISBN 9780313339875。
  2. ^ a b Kingsbury N (2009年10月15日).ハイブリッド：植物育種の歴史と科学. シカゴ大学出版局. ISBN 978-0-226-43705-7。
  3. ^ Hartl DL, Orel V (1992年6月). 「メンデルは何を発見したと思ったのか？」 .遺伝学. 131 (2): 245–53 . doi : 10.1093/genetics/131.2.245 . PMC 1205000. PMID 1644269 .  
  4. ^ Roberts RJ (2005年4月). 「制限酵素はいかにして分子生物学の主力となったか」 . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 102 (17): 5905–8 . Bibcode : 2005PNAS..102.5905R . doi : 10.1073 / pnas.0500923102 . PMC 1087929. PMID 15840723 .  
  5. ^ Weiss B, Richardson CC (1967年4月). 「酵素によるデオキシリボ核酸の切断と結合、I. T4バクテリオファージに感染した大腸菌由来の酵素系によるDNA一本鎖切断の修復」 .米国科学アカデミー紀要. 57 (4 ) : 1021–8 . Bibcode : 1967PNAS...57.1​​021W . doi : 10.1073/pnas.57.4.1021 . PMC 224649. PMID 5340583 .  
  6. ^ Lederberg J (1952年10月). 「細胞遺伝学と遺伝性共生」.生理学レビュー. 32 (4): 403–30 . CiteSeerX 10.1.1.458.985 . doi : 10.1152/physrev.1952.32.4.403 . PMID 13003535 .  
  7. ^ Mandel M, Higa A (1970年10月). 「カルシウム依存性バクテリオファージDNA感染」. Journal of Molecular Biology . 53 (1): 159– 62. doi : 10.1016/0022-2836(70)90051-3 . PMID 4922220 . 
  8. ^ Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S (1989年3月). 「電気穿孔法による11属に属するグラム陰性細菌の様々な種の形質転換」. Molecular & General Genetics . 216 (1): 175–7 . doi : 10.1007/BF00332248 . PMID 2659971. S2CID 25214157 .  
  9. ^ネスター、ユージン. 「アグロバクテリウム：天然の遺伝子工学者（100年後）」 . 2012年10月19日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2011年1月14日閲覧。
  10. ^ Zambryski P, Joos H, Genetello C, Leemans J, Montagu MV, Schell J (1983). 「植物細胞へのDNA導入における、通常の再生能力を損なうことのないTiプラスミドベクター」 . The EMBO Journal . 2 (12): 2143–50 . doi : 10.1002/j.1460-2075.1983.tb01715.x . PMC 555426. PMID 16453482 .  
  11. ^ 「生物学の再発見 - オンライン教科書：ユニット13 遺伝子組み換え生物」 www.learner.org 。 2019年12月3日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2017年8月18日閲覧。
  12. ^ a b c Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2002). 「遺伝子発現と機能の研究」 . Molecular Biology of the Cell . New York: Garland Science.
  13. ^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). 「突然変異型」 .遺伝子解析入門（第7版）.
  14. ^ Koh HJ, Kwon SY, Thomson M (2015-08-26). Current Technologies in Plant Molecular Breeding: A Guide Book of Plant Molecular Breeding for Researchers . Springer. p. 242. ISBN 9789401799966。
  15. ^ Roh JY, Choi JY, Li MS, Jin BR, Je YH (2007年4月). 「バチルス・チューリンゲンシスは、昆虫害虫防除における特異的かつ安全で効果的なツールとして期待されている」. Journal of Microbiology and Biotechnology . 17 (4): 547–59 . PMID 18051264 . 
  16. ^ Adler J (2011年5月). 「スーパー雑草の脅威の増大」. Scientific American . 304 (5): 74–9 . Bibcode : 2011SciAm.304e..74A . doi : 10.1038/scientificamerican0511-74 . PMID 21595408 . 
  17. ^国連食糧農業機関。「遺伝子組み換えのプロセス」。
  18. ^ a b Nicholl ST (2008年5月29日).遺伝子工学入門. ケンブリッジ大学出版局. ISBN 978-1-139-47178-7。
  19. ^ Michels CA (2002年6月10日).生物学研究のための遺伝学的手法：ケーススタディアプローチ. John Wiley & Sons. pp.  85– 88. ISBN 978-0-471-89919-8。
  20. ^ Alberts B, et al. (2002). "8" . DNAの単離、クローニング、および配列決定（第4版）. ニューヨーク: Garland Science.
  21. ^ Kaufman RI, Nixon BT (1996年7月). 「PCRを用いた多様な細菌からのシグマ54依存性活性化因子をコードする遺伝子の単離」 . Journal of Bacteriology . 178 (13): 3967–70. doi : 10.1128 / jb.178.13.3967-3970.1996 . PMC 232662. PMID 8682806 .  
  22. ^ Liang J, Luo Y, Zhao H (2011). 「合成生物学：生物学に合成を取り入れる」 . Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine . 3 (1): 7– 20. doi : 10.1002 / wsbm.104 . PMC 3057768. PMID 21064036 .  
  23. ^ 「GeneArt 遺伝子合成」 www.thermofisher.com . 2017年11月9日閲覧。
  24. ^ Berg P, Mertz JE (2010年1月). 「組み換えDNA技術の起源と出現に関する個人的な考察」 . Genetics . 184 (1): 9– 17. doi : 10.1534/genetics.109.112144 . PMC 2815933. PMID 20061565 .  
  25. ^ Nayerossadat N, Maedeh T, Ali PA (2012年7月6日). 「遺伝子送達のためのウイルスおよび非ウイルス送達システム」 . Advanced Biomedical Research . 1 : 27. doi : 10.4103/2277-9175.98152 . PMC 3507026. PMID 23210086 .  
  26. ^ a b Chen I, Dubnau D (2004年3月). 「細菌形質転換中のDNA取り込み」. Nature Reviews. Microbiology . 2 (3): 241–9 . doi : 10.1038/nrmicro844 . PMID 15083159. S2CID 205499369 .  
  27. ^ a b米国国立研究会議（National Research Council）遺伝子組み換え食品のヒトの健康に対する意図しない影響の特定と評価に関する委員会（2004年1月1日）「植物、動物、微生物の遺伝子操作の方法とメカニズム」全米科学アカデミー出版（米国）。
  28. ^ Gelvin SB (2003年3月). 「アグロバクテリウムを介した植物形質転換：遺伝子操作ツールの背後にある生物学」 . Microbiology and Molecular Biology Reviews . 67 ( 1): 16– 37, 目次. doi : 10.1128/MMBR.67.1.16-37.2003 . PMC 150518. PMID 12626681 .  
  29. ^ Francis KE, Spiker S (2005年2月). 「選抜を行わないシロイヌナズナ形質転換体の同定により、サイレンシングされたT-DNAの組み込みが高頻度に見られることが明らかになった」 . The Plant Journal . 41 (3): 464–77 . doi : 10.1111/j.1365-313x.2004.02312.x . PMID 15659104 . 
  30. ^ Schell J, Van Montagu M (1977). 「アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTiプラスミドは、植物へのNIF遺伝子導入のための天然ベクターか？」 Hollaender A, Burris RH, Day PR, Hardy RW, Helinski DR, Lamborg MR, Owens L, Valentine RC (編).窒素固定のための遺伝子工学. Basic Life Sciences. 第9巻. pp.  159– 79. doi : 10.1007/978-1-4684-0880-5_12 . ISBN 978-1-4684-0882-9. PMID  336023 .
  31. ^ Joos H, Timmerman B, Montagu MV, Schell J (1983). 「植物細胞におけるアグロバクテリウムDNAの移送と安定化に関する遺伝学的解析」 . The EMBO Journal . 2 (12): 2151–60 . doi : 10.1002 / j.1460-2075.1983.tb01716.x . PMC 555427. PMID 16453483 .  
  32. ^ Thomson JA. 「植物の遺伝子工学」（PDF） .バイオテクノロジー. 3. 2016年7月17日閲覧。
  33. ^ Leuzinger K, Dent M, Hurtado J, Stahnke J, Lai H, Zhou X, Chen Q (2013年7月). 「組換えタンパク質の高レベル一過性発現のための植物への効率的なアグロインフィルトレーション」 . Journal of Visualized Experiments . 77 (77). doi : 10.3791/50521 . PMC 3846102. PMID 23913006 .  
  34. ^ Head G , Hull RH, Tzotzos GT (2009).遺伝子組み換え植物：安全性評価とリスク管理ロンドン: Academic Pr. p.  244. ISBN 978-0-12-374106-6。
  35. ^ Alberts B , Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2002). Molecular Biology of the Cell . New York: Garland Science. p. G:35. ISBN 978-0-8153-4072-0。
  36. ^ a b Kamimura K, Suda T, Zhang G, Liu D (2011年10月). 「遺伝子送達システムの進歩」 .薬学医学. 25 (5): 293– 306. doi : 10.1007/bf03256872 . PMC 3245684. PMID 22200988 .  
  37. ^ Pack DW, Hoffman AS, Pun S, Stayton PS (2005年7月). 「遺伝子送達のためのポリマーの設計と開発」. Nature Reviews. Drug Discovery . 4 (7): 581–93 . doi : 10.1038/nrd1775 . PMID 16052241. S2CID 20972049 .  
  38. ^ 「講義8 動物細胞の遺伝子工学」 www.slideshare.net 2012年1月25日2018年7月18日閲覧。
  39. ^ Biocyclopedia.com. 「動物における遺伝子導入（トランスフェクション）法 | 遺伝子工学とバイオテクノロジー 遺伝子導入法とトランスジェニック生物 | 遺伝学、バイオテクノロジー、分子生物学、植物学 | Biocyclopedia.com」。biocyclopedia.com。2018年7月18日閲覧。
  40. ^ Kim, Tae Kyung; Eberwine, James H. (2010年8月). 「哺乳類細胞へのトランスフェクション：現在と未来」.分析・生化学分析化学. 397 (8): 3173– 3178. doi : 10.1007/s00216-010-3821-6 . ISSN 1618-2642 . PMC 2911531. PMID 20549496 .   
  41. ^ Mullin A. 「Pronuclear Injection」チューレーン大学. 2016年8月9日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2018年7月19日閲覧。
  42. ^ 「胚性幹細胞を介した遺伝子移入 - トランスジェニック動物」sites.google.com . 2018年7月19日閲覧。
  43. ^米国国立医学図書館医学件名表（MeSH）の「Transduction, Genetic」
  44. ^ 「幹細胞リダイレクト」 stemcells.nih.gov . 2017年1月20日時点のオリジナルよりアーカイブ。2016年7月6日閲覧。
  45. ^ Tuomela M, Stanescu I, Krohn K (2005年10月). 「バイオ分析法のバリデーション概要」.遺伝子治療. 12 Suppl 1 (S1): S131–8. doi : 10.1038/sj.gt.3302627 . PMID 16231045 . 
  46. ^ Narayanaswamy S (1994).植物細胞と組織培養. Tata McGraw-Hill Education. pp. vi. ISBN 9780074602775。
  47. ^ウォルター、ピーター；ロバーツ、キース；ラフ、マーティン；ルイス、ジュリアン；ジョンソン、アレクサンダー；アルバーツ、ブルース (2002). 「遺伝子発現と機能の研究」 .細胞の分子生物学. 第4版.
  48. ^ Hohn B, Levy AA, Puchta H (2001年4月). 「トランスジェニック植物からの選択マーカーの除去」Current Opinion in Biotechnology . 12 (2): 139–43 . doi : 10.1016/S0958-1669(00)00188-9 . PMID 11287227 . 
  49. ^ Setlow JK (2002-10-31).遺伝子工学：原理と方法. Springer Science & Business Media. p. 109. ISBN 9780306472800。
  50. ^ Deepak S, Kottapalli K, Rakwal R, Oros G, Rangappa K, Iwahashi H, Masuo Y, Agrawal G (2007年6月). 「リアルタイムPCR：遺伝子の検出と発現解析に革命を起こす」 . Current Genomics . 8 (4): 234–51 . doi : 10.2174/138920207781386960 . PMC 2430684. PMID 18645596 .  
  51. ^ Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2000). 「第8.5章 遺伝子置換とトランスジェニック動物：DNAは様々な方法で真核細胞に導入される」.分子細胞生物学（第4版）. WH Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-3136-8。
  52. ^ a bロシャ＝マルティンス、マウリシオ;カヴァヘイロ、ガブリエル R.マトス・ロドリゲス、ガブリエル・E。マルティンス、ロドリゴ、A. P.;ロシャ・マルティンス、マウリシオ。カヴァヘイロ、ガブリエル R.マトス・ロドリゲス、ガブリエル・E。マルティンス、ロドリゴ、A. P. (2015 年 8 月)。「遺伝子ターゲティングからゲノム編集まで: トランスジェニック動物への応用とその先へ」。アナイス・ダ・アカデミア・ブラジレイラ・デ・シエンシアス。87 (2): 1323–1348。土井: 10.1590/0001-3765201520140710。ISSN 0001-3765。PMID 26397828。  
  53. ^ a b c d Carroll D (2011年8月). 「ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたゲノム工学」 . Genetics . 188 ( 4): 773–82 . doi : 10.1534/genetics.111.131433 . PMC 3176093. PMID 21828278 .  
  54. ^ Grizot S, Smith J, Daboussi F, Prieto J, Redondo P, Merino N, Villate M, Thomas S, Lemaire L, Montoya G, Blanco FJ, Pâques F, Duchateau P (2009年9月). 「改変単鎖ホーミングエンドヌクレアーゼによるSCID遺伝子の効率的な標的化」 . Nucleic Acids Research . 37 (16): 5405–19 . doi : 10.1093/nar/ gkp548 . PMC 2760784. PMID 19584299 .  
  55. ^ Gao H, Smith J, Yang M, Jones S, Djukanovic V, Nicholson MG, West A, Bidney D, Falco SC, Jantz D, Lyznik LA (2010年1月). 「トウモロコシにおける設計されたエンドヌクレアーゼを用いた遺伝性標的変異誘発」. The Plant Journal . 61 (1): 176– 87. doi : 10.1111/j.1365-313X.2009.04041.x . PMID 19811621 . 
  56. ^ Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF (2009年5月). 「改変ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた植物遺伝子の高頻度改変」 . Nature . 459 ( 7245): 442–5 . Bibcode : 2009Natur.459..442T . doi : 10.1038/nature07845 . PMC 2743854. PMID 19404258 .  
  57. ^ Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, DeKelver RC, Moehle EA, Worden SE, Mitchell JC, Arnold NL, Gopalan S, Meng X, Choi VM, Rock JM, Wu YY, Katibah GE, Zhifang G, McCaskill D, Simpson MA, Blakeslee B, Greenwalt SA, Butler HJ, Hinkley SJ, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD (2009年5月). 「ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたトウモロコシ（Zea mays）の精密ゲノム改変」. Nature . 459 (7245): 437–41 . Bibcode : 2009Natur.459..437S . doi : 10.1038/nature07992 . PMID 19404259 . S2CID 4323298 .  
  58. ^ Christian M, Cermak T, Doyle EL, Schmidt C, Zhang F, Hummel A, Bogdanove AJ, Voytas DF (2010年10月). 「TALエフェクターヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断の標的化」 . Genetics . 186 (2): 757–61 . doi : 10.1534/genetics.110.120717 . PMC 2942870. PMID 20660643 .  
  59. ^ Li T, Huang S, Jiang WZ, Wright D, Spalding MH, Weeks DP, Yang B (2011年1月). 「TALヌクレアーゼ（TALN）：TALエフェクターとFokI DNA切断ドメインからなるハイブリッドタンパク質」 . Nucleic Acids Research . 39 (1): 359– 72. doi : 10.1093 / nar/gkq704 . PMC 3017587. PMID 20699274 .  
  60. ^ Esvelt KM, Wang HH (2013). 「システム生物学と合成生物学のためのゲノムスケールエンジニアリング」 . Molecular Systems Biology . 9 : 641. doi : 10.1038/msb.2012.66 . PMC 3564264. PMID 23340847 .  
  61. ^ Tan WS, Carlson DF, Walton MW, Fahrenkrug SC, Hackett PB (2012). 「大型動物ゲノムの精密編集」. Advances in Genetics Volume 80. pp.  37– 97. doi : 10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8 . ISBN 9780124047426. PMC  3683964 . PMID  23084873 .
  62. ^ a b c d Malzahn, Aimee; Lowder , Levi; Qi, Yiping (2017). 「TALENとCRISPRによる植物ゲノム編集」 . Cell & Bioscience . 7 : 21. doi : 10.1186/s13578-017-0148-4 . PMC 5404292. PMID 28451378 .  
  63. ^ Boissel S, Jarjour J, Astrakhan A, Adey A, Gouble A, Duchateau P, Shendure J, Stoddard BL, Certo MT, Baker D, Scharenberg AM (2014年2月). 「megaTALs：治療ゲノム工学のための希少切断ヌクレアーゼアーキテクチャ」 . Nucleic Acids Research . 42 (4): 2591– 601. doi : 10.1093 / nar/gkt1224 . PMC 3936731. PMID 24285304 .  
  64. ^ Choulika, A.; Perrin, A.; Dujon, B.; Nicolas, JF (1994). 「酵母I-Sce Iメガヌクレアーゼは哺乳類細胞において部位特異的染色体組換えを誘導する」.アカデミー科学誌, 第3シリーズ. 317 (11): 1013–9 . PMID 7882137 . 
  65. ^ a b c Silva G, Poirot L, Galetto R, Smith J, Montoya G, Duchateau P, Pâques F (2011年2月). 「メガヌクレアーゼと標的ゲノム工学のためのその他のツール：遺伝子治療の展望と課題」 . Current Gene Therapy . 11 (1): 11– 27. doi : 10.2174/156652311794520111 . PMC 3267165. PMID 21182466 .  
  66. ^ Silva GH, Belfort M, Wende W, Pingoud A (2006年8月). 「モノマー型エンドヌクレアーゼからホモダイマー型エンドヌクレアーゼへ、そしてその逆へ：LAGLIDADG酵素の新たな特異性エンジニアリング」. Journal of Molecular Biology . 361 (4): 744–54 . doi : 10.1016/j.jmb.2006.06.063 . PMID 16872628 . 
  67. ^ Christian, M.; Cermak, T.; Doyle, EL; Schmidt, C.; Zhang, F.; Hummel, A.; Bogdanove, AJ; Voytas, DF (2010). 「TALエフェクターヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断の標的化」 . Genetics . 186 ( 2): 757– 761. doi : 10.1534/genetics.110.120717 . PMC 2942870. PMID 20660643 .  
  68. ^ Cyranoski, D. (2019). 「CRISPRベビーの今後は？」 . Nature . 566 (7745): 440–442 . doi : 10.1038/d41586-019-00673-1 . PMID 30809070 . 
  69. ^ Rees, H.; Liu, DR (2018). 「塩基編集：生細胞のゲノムとトランスクリプトームにおける精密化学」 . Nature Reviews Genetics . 19 (12): 770– 788. doi : 10.1038/s41576-018-0059-1 . PMC 6535181. PMID 30323312 .  
  70. ^ Anzalone, AV; Randolph, PB; Davis, JR (2019). 「二本鎖切断やドナーDNAを使用しない検索・置換ゲノム編集」 . Nature . 576 (7785): 149– 157. Bibcode : 2019Natur.576..149A . doi : 10.1038 / s41586-019-1711-4 . PMC 6907074. PMID 31634902 .  
「 https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=遺伝子工学技術&oldid =1315233419」より取得